In-vitro-tRNA Methylierungs-Assay mit der Entamoeba histolytica DNA und tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines synthetischen tRNA Substrat für die<em> Entamoeba histolytica</em> DNA / tRNA-Methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth und das Maß ihrer Methyltransferase-Aktivität. Dieser experimentelle Ansatz zur Untersuchung der Aktivität anderer Dnmt2 Proteine verwendet werden.
Abstract
Einzellige Parasiten gehören zu den verheerendsten Krankheitserreger des Menschen verantwortlich für eine Vielzahl von Erkrankungen wie Amöbiasis, die eine der drei häufigsten Todesursachen von parasitäre Erkrankung ist. Der Agent der Amöbiasis ist die Amöbe Parasiten Entamoeba histolytica, die unter zwei Stufen besteht: die infektiöse Zyste in Nahrung oder Wasser und die invasive Trophozoiten leben im Darm gefunden. Die klinischen Symptome der Amöbiasis Bereich entfernt, asymptomatische zu Kolitis, Ruhr oder Leberabszesse. E. histolytica ist einer der seltenen einzellige Parasit mit 5-Methylcytosin (5MC) in ihrem Genom. 1, 2 Es enthält ein einziges DNA-Methyltransferase, Ehmeth, dass die Dnmt2 Familie gehört. 2 A Rolle für Dnmt2 in der Kontrolle von repetitiven Elementen hat wurde in E. gegründet histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 und Drosophila. 6 Unsere jüngsten Arbeiten haben gezeigt, dass Ehmeth methyliert tRNA Asp, und dieser Befund deutet darauf hin, dass dieses Enzym eine doppelte DNA / tRNA Asp Methyltransferase-Aktivität hat. 7 Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Dual-Aktivität das hat für D. berichtet discoideum und D. melanogaster. 8 Die funktionelle Bedeutung der DNA / tRNA Spezifität von Enzymen Dnmt2 ist noch unbekannt. Um diese Frage zu beantworten, wurde eine Methode zur tRNA Methyltransferase-Aktivität von Proteinen zu bestimmen Dnmt2 gegründet. In diesem Video, beschreiben wir eine einfache Lösung, um eine ausreichende tRNA Substrat für Dnmt2 vorzubereiten und eine Methode, um ihre tRNA Methyltransferase-Aktivität zu messen.
Protocol
Discussion
In diesem Vortrag dargestellt wir, wie man aktive Komponenten für das Maß der tRNA Methyltransferase-Aktivität von E. vorbereiten histolytica Ehmeth Enzym. Dieser Vorgang kann als Ausgangspunkt dienen und einfach für die Maßnahme von anderen tRNA-Methyltransferasen angepasst werden. Es ist wichtig, die Verfahren, die die Qualität und die Integrität der tRNA Substrat und der tRNA-Methyltransferase-Protein zu erhalten, um eine optimale Maß für die enzymatische Aktivität zu versichern folgen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Israel Science Foundation und der Rappaport Family Institute for Research in Medical Sciences und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
| NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
| Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
| Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
| Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
| Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
| Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
| Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
| BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
| Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
| TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
| Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
| Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
| IPTG | Sigma | I6758 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
| Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
| Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
| Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
| L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
| AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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