우리가 편리하게 HEK293T 세포의 표면에 odorant 수용체를 감지하는 데 사용할 수있는 라이브 세포 얼룩을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한, 그것은 또한 다른 chemosensory 수용체 또는 GPCRs의 표면 표현 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
냄새의 생생한 세상은 후각의 감각에 의해 인식됩니다. 생쥐의 후각은 휘발성 odorant 분자 바인딩하는 postulated 및 G 단백질과 결합하여 Gαolf 세포내 신호에 세포 신호를 변환하는 1200에 대한 G 단백질 결합 수용체의 (GPCRs) 1 레파토리에 의해 중재됩니다. 수용체에 odorants의 바인딩하면 하나 odorant 여러 수용체를 묶어 수 있습니다 한 수용체가도 2 다양한 여러 odorants를 바인딩 수있는 조합 규칙을 따를 생각입니다. 생화학, 신호 및 리간드 바인딩 연구 편리 heterologous 세포를 사용하는 대부분의 GPCRs에 대한 실시되었습니다. transfection에 그들은 표면에 수출하는 데 실패 때문에 그러나, odorant 수용체의 연구 heterologous 세포의 사용은 오랫동안 배제되었다. 사이토 외 가족 보호자들이 공동으로 함께 3 transfected heterologous 세포의 표면에 트래픽 odorant 수용체에 보호자로 후각 감각 뉴런과 행동의 강화된 표현을 보여주 단백질을 운반 단일 막 통과 수용체 (RTP)을 증명하고있다. 수용체는 세포 라인의 강력한 표면 표현을 보여주는 경우 heterologous 세포를 이용하여 수용체에 대한 생화 학적 assays을 수행하는 하나 먼저 확인해야합니다. 이것은 찬란 독점적으로 세포외 도메인의 세포외 도메인이나 태그를 레이블에 얼룩 라이브 셀 다음에 보호자의 RTP1S와 overexpressing 수용체에 의해 assayed 수 있습니다. 우리가 편리하게 HEK293T 세포의 표면에 odorant 수용체를 감지하는 데 사용할 수있는 라이브 세포 얼룩을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한, 그것은 또한 다른 chemosensory 수용체 또는 GPCRs의 표면 표현 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 절차 :
절차는 삼일 총 시간이 지남에 따라 완성된 세 부분으로 구성되어 전송 세포 transfection과 immunocytochemistry, 하루에 실시 한 걸음. 처음 두 일 동안 전송 및 세포의 transfection은 층류 챔버에 무균 상태에서 실시해야합니다.
1 일 : 표면 표현 분석에 대한 HEK293T 세포의 양도.
- 전송 매체 (M10) : 믹스 10 % (부피가) 무균 상태에서 태아 소 혈청과 보충 최소 필수적인 매체.
- 설정하는 데 필요한 접시의 숫자에 따라, 100mm 문화 판에서 원하는 confluency에 세포를 성장. 자란 또는 스파스 세포를 피하로 전송하는 세포의 분율을 결정하는 것이 중요합니다 : 예를 들어, 100 % 합류 100mm 요리에서, 하나는의 30 % confluency를 구하는 35mm 요리로 약 3 %를 양도할 수 있습니다 후자.
- 이전 멸균 층류 챔버, 코트 22, 세포를 전송 멸균 폴리 D 라이신 (1mg / ML) 각 35mm의 세포 배양 접시에서 개최 한 도금 전지 코팅 측면까지 함께 X 22mm 유리 커버 풀렸는데 (그림 1 ). 십분 - 5 건조에 대한 해결책을 허용합니다. 원하는....
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토론
각 단계는 두드러진과 독특한 표면 얼룩을 보장하기 위해 신중하게 진행되어야합니다. 전체 얼룩 과정 (얼음) 추위에 실시해야하며 커버 전표가 마련하고있는 트레이는 세포가 살아있을 수 있도록 사용하기 전에 냉각해야합니다. 또한 고정은 표면 얼룩 프로세스의 끝에 이루어집니다. 이것은 고정은 기본 및 보조 항체로 세포막을 permeabilize에 얼룩 앞에 내부 얼룩과 선명한 대조이다. 공기 커버 전표의 노출 시간이 최대 건조에서 세포를 방지하기 위해 최소화되어야하며 항체 솔루션으로 커버 전표의 우위를 겹겹이, 솔루션을 씻어 표지 전표 전송, 세척 사이 씻어 솔루션의 교환은 한 번에 빠르게 한 이루어져야합니다 여러 개의 커버 전표를 다룰 때.
에피토프 태그와 항체 일 사용에 따라, 하나는 부화 시간, 세척의 수를, 그리고 항체 희석의 접을를 조정해야 할 수도 있습니다. 배경 잡음은 항체를 더 diluting 또는 세척의 수를 증가하거나, 부화 시간을 단축함으로써 피할 수 있습니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는이 원고의 중요한 읽기위한 마츠 실험실의 구성원 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 커버슬립 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| 소 태아 혈청 | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| 필수 최소 배지 | Sigma-Aldrich | M4655 | L glutamate, Earle’s salt 및 bicarbonate 포함 |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| 파라포름알데히드 | EMS | 19208 | |
| Hanks 균형 염액 (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 염화 칼슘 및 염화 마그네슘 포함 |
| HEPES 완충 용액 | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| 인산 완충 식염수 (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | 칼슘 및 마그네슘 제외 |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| 아지드화 나트륨 | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| 조직 배양 접시 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
참고문헌
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H.....
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재인쇄 및 허가
