Plaque de microtitrage biofilm essai de formation
Summary
Le test décrit un moyen rapide pour mesurer la formation de biofilm au début de bactéries et de champignons. Cette méthode utilise une plaque de microtitration comme substrat pour la formation de biofilms microbiens et le biofilm est visualisée en utilisant la souche de cristal violet. Le test fournit soit un test qualitatif ou quantitatif pour la formation de biofilm tôt.
Abstract
Les biofilms sont des communautés de microbes attachés à des surfaces, qui peuvent être trouvés dans les milieux médicaux, industriels et naturels. En fait, la vie dans un biofilm représente probablement le mode prédominant de la croissance des microbes dans la plupart des environnements. Biofilms matures ont quelques caractéristiques distinctes. Microbes biofilm sont généralement entourés d'une matrice extracellulaire qui fournit la structure et la protection de la communauté. Les microbes de plus en plus dans un biofilm ont aussi une architecture caractéristique généralement composé de macrocolonies (contenant des milliers de cellules) entourés par des canaux remplis de fluide. Biofilm cultivés microbes sont également connus pour leur résistance à une gamme d'agents antimicrobiens, y compris des antibiotiques cliniquement pertinents.
Le dosage de plaque de microtitrage est un outil important pour l'étude des premières étapes dans la formation de biofilms, et a été appliquée essentiellement pour l'étude des biofilms bactériens, bien que ce test a également été utilisée pour étudier la formation de biofilms fongiques. Parce que ce test utilise statique, par lots des conditions de croissance, il ne permet pas à la formation des biofilms matures généralement associés aux systèmes de cellule d'écoulement. Cependant, le dosage a été efficace pour identifier les nombreux facteurs requis pour l'initiation de la formation du biofilm (ie, les flagelles, pili, adhésines, enzymes impliquées dans cyclique-di-GMP contraignant et métabolisme) et ainsi que des gènes impliqués dans la production de polysaccharide extracellulaire. Par ailleurs, des travaux publiés indiquent que les biofilms cultivés dans des plaques de microtitrage ne développent certaines propriétés des biofilms matures, une telle tolérance aux antibiotiques et la résistance aux effecteurs du système immunitaire.
Ce test microtitration simples plat permet la formation d'un biofilm sur les parois et / ou fond d'un plat de microtitration. La nature à haut débit de l'essai le rend utile pour les écrans de génétique, ainsi que la formation de biofilms par des souches multiples tests dans des conditions de croissance différentes. Des variantes de ce test ont été utilisés pour évaluer la formation de biofilm tôt pour une grande variété de microbes, y compris mais non limité à, les pseudomonades, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocoques, les entérocoques, les mycobactéries et les champignons.
Dans le protocole décrit ici, nous allons nous concentrer sur l'utilisation de ce test pour étudier la formation de biofilm par le aeruginosa Pseudomonas organisme modèle. Dans cet essai, l'étendue de la formation du biofilm est mesuré en utilisant le colorant cristal violet (CV). Cependant, un certain nombre d'autres taches colorimétriques et métaboliques ont été rapportées pour la quantification de la formation de biofilms en utilisant le dosage de plaque de microtitrage. La facilité, son faible coût et la flexibilité de l'essai de plaque de microtitrage en a fait un outil essentiel pour l'étude des biofilms.
Protocol
Discussion
Cette méthode peut être modifié pour être utilisé avec une grande variété d'espèces microbiennes. Microbes mobiles généralement adhérer aux parois et / ou fond des puits, tandis que non mobiles microbes normalement adhérer au fond des puits. Les conditions optimales pour la formation du biofilm (ie, le milieu de croissance, température, temps d'incubation) doit être déterminée empiriquement pour chaque microbe. Je vous recommandons d'effectuer plusieurs répétitions pour chaque souche ou la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mes remerciements à Sherry Koutchma, Pete Newell et Robert Shanks pour fournir les images de la figure 1. Ce travail a été soutenu par NIH R01AI083256 au GAO
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | |||
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | ||
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | ||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | ||
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. | |
| Glucose | Fisher | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Casamino acids | Beckton-Dickinson | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Arginine | Sigma | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids | |
| Microtiter plates | Beckton-Dickinson | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. | |
| Microtiter plate lids | Beckton-Dickinson | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. | |
| Crystal violet | Sigma | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
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