Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione
Summary
Il saggio descrive un modo rapido per misurare la rapida formazione di biofilm in batteri e funghi. Questo metodo utilizza una micropiastra come substrato per la formazione di biofilm microbico, e il biofilm viene visualizzato per mezzo viola ceppo di cristallo. Il saggio fornisce sia un test qualitativo o quantitativo per la formazione di biofilm presto.
Abstract
I biofilm sono comunità di microbi attaccati alle superfici, che si trova in campo medico, industriale e naturale. In realtà, la vita in un biofilm rappresenta probabilmente la modalità predominante di crescita per i microbi nella maggior parte degli ambienti. Biofilm mature hanno alcune caratteristiche distinte. Microbi biofilm sono in genere circondate da una matrice extracellulare che fornisce la struttura e la protezione per la comunità. I microbi che crescono in un biofilm hanno anche una caratteristica architettura generalmente costituiti da macrocolonies (contenente migliaia di cellule) circondato da piene di liquido canali. Biofilm cresciuto microbi sono anche noti per la loro resistenza a una vasta gamma di agenti antimicrobici, inclusi gli antibiotici clinicamente rilevanti.
Il test piatto micropiastra è uno strumento importante per lo studio delle prime fasi di formazione di biofilm, ed è stato applicato principalmente per lo studio dei biofilm batterici, anche se questo test è stato utilizzato anche per studiare la formazione di biofilm fungine. Poiché questo test utilizza statica, batch condizioni di crescita, non consentono la formazione di biofilm maturo tipicamente associati ai sistemi di cella di flusso. Tuttavia, il test si è dimostrato efficace a individuare molti fattori necessari per l'inizio della formazione di biofilm (cioè, flagelli, pili, adesine, enzimi coinvolti nella ciclico-di-GMP vincolanti e metabolismo) e così come i geni coinvolti nella produzione di polisaccaridi extracellulari. Inoltre, opera pubblicata indica che i biofilm cresciuto in piatti microtitolazione si sviluppano alcune proprietà di biofilm maturo, una tale tolleranza agli antibiotici e la resistenza alle effettori del sistema immunitario.
Questo semplice test piatto microtitolazione consente la formazione di un biofilm sulla parete e / o fondo di un piatto di microtitolazione. La natura elevato throughput del test lo rende utile per schermi genetico, così come la formazione di biofilm test da ceppi diversi, in condizioni di crescita diverse. Le varianti di questo test sono stati utilizzati per valutare la formazione di biofilm presto per una grande varietà di microbi, inclusi ma non limitati a, Pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococchi, micobatteri e funghi.
Nel protocollo qui descritto, ci concentreremo sull'uso di questo test per studiare la formazione di biofilm da Pseudomonas aeruginosa organismo modello. In questo saggio, l'estensione della formazione di biofilm è misurata utilizzando il colorante cristal violetto (CV). Tuttavia, una serie di altre macchie colorimetriche e metabolici sono stati segnalati per la quantificazione della formazione di biofilm utilizzando il test micropiastra. L', facilità a basso costo e flessibilità del dosaggio micropiastra ha reso uno strumento fondamentale per lo studio dei biofilm.
Protocol
Discussion
Questo metodo può essere modificato per essere utilizzato con una grande varietà di specie microbiche. Microbi mobili tipicamente aderire alle pareti e / o fondo dei pozzi, mentre non mobili microbi tipicamente aderire al fondo dei pozzetti. Le condizioni ottimali per la formazione di biofilm (cioè, terreno di coltura, temperatura, tempo di incubazione) devono essere determinati empiricamente per ogni microbo. Vi consiglio l'esecuzione di più repliche per ogni ceppo o condizione (4-8), e tra un controllo positiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I miei ringraziamenti a Sherry Kuchma, Pete Newell e Robert Shanks per aver fornito le immagini in Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01AI083256 al GAO
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | |||
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | ||
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | ||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | ||
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. | |
| Glucose | Fisher | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Casamino acids | Beckton-Dickinson | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Arginine | Sigma | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids | |
| Microtiter plates | Beckton-Dickinson | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. | |
| Microtiter plate lids | Beckton-Dickinson | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. | |
| Crystal violet | Sigma | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
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