Analysen beskriver ett snabbt sätt att mäta tidiga biofilm bildas i bakterier och svampar. Denna metod använder en mikrotiterplatta som substrat för mikrobiell biofilm bildning och biofilmen visualiseras med hjälp av stam kristallviolett. Analysen ger antingen en kvalitativ eller kvantitativ analys för tidigt biofilm bildas.
Biofilmer är samhällen av mikrober knutna till ytor som kan hittas i medicin, industri och naturliga inställningar. I själva verket representerar livet i en biofilm förmodligen dominerar läge för tillväxt för mikrober i de flesta miljöer. Mogna biofilmer har några tydliga särdrag. Biofilm mikrober är oftast omgivna av en extracellulär matrix som ger struktur och skydd för samhället. Mikrober som växer i en biofilm har också en karakteristisk arkitektur i allmänhet består av macrocolonies (innehåller tusentals celler) omgiven av vätskefyllda kanaler. Biofilm odlade mikrober är också kända för sitt motstånd mot en rad av antimikrobiella medel inklusive kliniskt relevanta antibiotika.
Den mikroteststrips maträtt analys är ett viktigt verktyg för studiet av de tidiga skedena i biofilm bildning, och har tillämpats i första hand för studier av bakteriell biofilm, även om denna analys har också använts för att studera svamp biofilm bildas. Eftersom denna analys använder statiska, batch-tillväxt förhållanden tillåter det inte för bildandet av mogna biofilmer som vanligtvis förknippas med flödessystem cell. Däremot har analysen varit effektiv på att identifiera många faktorer som krävs för initiering av biofilm bildning (dvs flageller, pili, adhesinerna, enzymer involverade i cykliska-di-GMP bindande och ämnesomsättning) och liksom gener involverade i extracellulär polysackarid produktion. Vidare visar publicerade arbeten som biofilmer odlas i mikroteststrips rätter inte utveckla några egenskaper hos mogna biofilm, en sådan antibiotika tolerans och motstånd mot immunförsvaret effectors.
Denna enkla mikroteststrips maträtt analysen möjliggör bildandet av en biofilm på väggen och / eller botten av en mikrotiter maträtt. Den höga genomströmningen natur-analysen gör den användbar för genetisk skärmar, samt testning biofilm bildning av flera stammar under olika odlingsbetingelser. Varianter av denna analys har använts för att bedöma tidigt biofilm formation för en mängd olika mikrober, inklusive men inte begränsat till, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterokocker, mykobakterier och svampar.
I protokollet beskrivs här, kommer vi att fokusera på användningen av denna analys för att studera biofilm bildning av modellen organismen Pseudomonas aeruginosa. I denna analys, är omfattningen av biofilm bildas mäts med hjälp av färgen kristallviolett (CV). Däremot har ett antal andra kolorimetriska och metabola fläckar rapporterats för kvantifiering av biofilm bildas med hjälp av analysen mikrotiterplattan. Den lätthet, låga kostnader och flexibilitet mikrotiterplatta analysen har gjort det ett viktigt verktyg för studier av biofilmer.
Denna metod kan modifieras för att användas med en mängd olika mikroorganismer. Rörliga mikrober följer vanligtvis på väggarna och / eller botten av brunnarna, medan icke-rörliga mikrober vanligtvis hålla sig till botten av brunnarna. Den optimala förutsättningar för biofilm bildning (dvs tillväxt medium, temperatur, tid för inkubation) skall bestämmas empiriskt för varje mikrob. Jag rekommenderar utföra flera replikat för varje stam eller villkor (4-8), och med en positiv kontroll, och om möjligt, en…
The authors have nothing to disclose.
Tack till Sherry Kutjma, Pete Newell och Robert Shanks för att ge bilderna i figur 1. Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01AI083256 till Gao
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | |||
KH2PO4 | Fisher | P285-500 | ||
K2HPO4 | Fisher | P288-500 | ||
(NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | ||
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. | |
Glucose | Fisher | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
Casamino acids | Beckton-Dickinson | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
Arginine | Sigma | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids | |
Microtiter plates | Beckton-Dickinson | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. | |
Microtiter plate lids | Beckton-Dickinson | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. | |
Crystal violet | Sigma | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |