גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography
Summary
פרוטוקול זה מתאר assay פעילות מבוססי לאיתור metalloproteinases מטריקס supernatants תרבות או נוזלי גוף.
Abstract
Metalloproteinases מטריקס (MMPs) הם אבץ המכיל endopeptidases. הם לבזות חלבונים על ידי המחשוף של אג"ח פפטיד. יותר מעשרים MMPs זוהו מופרדות לשש קבוצות על בסיס המבנה שלהם ואת המצע סגוליות (collagenases, gelatinases, סוג קרום [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, ואחרים). MMPs לשחק תפקיד קריטי בפלישה התא, השפלה סחוס, שיפוץ רקמות, ריפוי פצעים, ועל העובר. לכן הם להשתתף בשני תהליכים נורמליים בפתוגנזה של מחלות רבות, כגון דלקת מפרקים שגרונית סרטן, או מחלת ריאות חסימתית כרונית 1-6. כאן נתמקד MMP-2 (gelatinase, סוג IV collagenase), MMP ביטוי נרחב. אנו מדגימים כיצד לזהות MMP-2 ב supernatants תרבית תאים על ידי zymography, נפוץ, טכניקה פשוטה, ובכל זאת מאוד רגיש שתוארה לראשונה על ידי ג Heussen ו EB דאודל 7-10 בשנת 1980. טכניקה זו היא חצי כמותית, ולכן הוא יכול לשמש כדי לקבוע רמות MMP בדגימות מבחן כאשר הריכוזים הידועים של MMP רקומביננטי נטענים על ג'ל אותו 11.
פתרונות המכיל MMPs (למשל תרבית תאים supernatants, שתן, או בסרום) נטענים ג'ל polyacrylamide המכיל נתרן גופרתי dodecyl (SDS, כדי linearize את החלבונים) ו ג'לטין (המצע של MMP-2). חיץ מדגם נועד להגביר צמיגות מדגם (כדי להקל על טעינת ג'ל), לספק צבע מעקב (כחול bromophenol; לפקח הגירה לדוגמה), לספק מולקולות denaturing (עד linearize חלבונים), וכן לשלוט על ה-pH של המדגם. חלבונים מותר אז להעביר תחת זרם חשמלי במאגר ריצה נועד לספק קצב העברה קבוע. המרחק של הגירה היא בקורלציה הפוכה עם משקל מולקולרי של החלבון (חלבונים קטנים לנוע מהר יותר מאשר באמצעות ג'ל חלבונים גדולים לעשות ולכן להגר בהמשך הג'ל). לאחר ההגירה, הג'ל מושם חיץ renaturing לאפשר חלבונים להחזיר מבנה שלישוני שלהם, הדרושים הפעילות האנזימטית. הג'ל מושם אז חיץ בפיתוח נועד לאפשר פרוטאז לעכל את המצע שלה. המאגר מכיל גם בפיתוח p-aminophenylmercuric אצטט (APMA) כדי להפעיל את הלא proteolytic הפרו MMPs לתוך MMPs פעיל. הצעד הבא מורכב מכתים את המצע (ג'לטין בדוגמה שלנו). לאחר שטיפת צבע עודף את הג'ל, תחומי העיכול פרוטאז יופיעו להקות ברור. ברור הלהקה, מרוכז יותר פרוטאז שהוא מכיל. מכתים עוצמת בנד אז יכול להיות נקבע על פי צפיפות, באמצעות תוכנה כגון ImageJ, המאפשרות השוואה המדגם.
Protocol
Discussion
אנחנו הדגימו כיצד לבצע ניתוח zymographic של MMP-2 ב supernatants תרבית תאים.
כמות המדגם כדי לטעון את הג'ל צריכה להיקבע באופן אמפירי בהתאם למקור ו MMP של עניין. טעינת מעט מדי ימנע גילוי בעת טעינת מדי עלול להוביל הרוויה כפי שיש כל כך הרבה רק המצע פרוטאז יכולים לעכל באזור של הלהקה. במידת הצורך, את המדגם יכול להיות מדולל במים deionized לפני ערבוב עם חיץ העמסה או הזמן לפתח יכולות מופחת דה מן לילה עד 4 שעות. אפשר גם לרכז חלבונים בתמיסה באמצעות ריכוז (למשל קטלוג Millipore # UFC803024). אם להקות להישאר בקושי נראה, זה עשוי להיות נחוץ כדי לפתח את הג'לים לתקופה ארוכה של זמן, אפילו עד 48 שעות. בעת הכנת דגימות supernatants בתרבית רקמה, יש לציין כי בסרום שור העובר (וסרה אחרים) מכיל MMPs שיכולים להשפיע על התוצאות. מסיבה זו, אנו אוספים את כל supernatants שלנו לאחר התרבות בינוני בסרום חינם.
שוטף המתוארים בסעיפים 2.9 ו – 2.10 של פרוטוקול נחוצים כדי להסיר את הרקע מכתים של להקות מעוכל. פעמים לשטוף ארוכים תסיר את הרקע יותר, אבל יהיו גם כתמים עמומים של המצע לאורך הג'ל. אם כבר לשטוף פעמים יש צורך, מומלץ לסרוק את הג'ל כל כמה שעות כדי לבחור את הסריקה עם ניגודיות את הטוב ביותר.
טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות MMPs אחרים. לדוגמה, MMP-9 ניתן להבחין על ג'לים ג'לטין, וגם במידה נמוכה MMP-1, MMP-8, ו – MMP-13 כמו ג'לטין אינו המצע המועדף עליהם. MMP-1 ו – MMP-13 מזוהים הטוב ביותר zymography קולגן תוך קזאין הוא המצע המועדף MMP-11 וגם מאפשר זיהוי של MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12, ו – MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) ו collagenases (MMP-1 ו – MMP-13) קשה לזהות כאשר נוכח רמות נמוכות של קזאין או ג'לים ג'לטין. תוספת של הפרין המדגם בזמן הטעינה ג'ל משפר באופן משמעותי את גבול הגילוי של MMP-7. עבור MMP-1 ו-MMP-13, הפרין צריך להוסיף ג'ל לאחר ריצה electrophoretic כבר בעיצומן 12.
מאז zymography אמצעים הפעילות האנזימטית לאחר denaturation ו renaturation של אנזימים, זה יהיה למדוד את הפעילות של כל MMPs הנוכחית במדגם. זה כולל אנזימים, הפרו אנזימים, ואנזימים חייב מעכבי אנדוגני (למשל TIMP-2). זה אפשרי אך כדי לקבוע את רמת ההפעלה MMP במדגם על ידי השוואת צפיפות הלהקה של האנזים פעיל מזה של הפרו האנזים, אשר יהיה בעל משקל מולקולרי גבוה מעט יותר.
Zymography הוא לעתים קרובות לא מספיק כדי לזהות MMP. השוואה של רמת ההגירה של MMP עם ידוע סטנדרטים משקל מולקולרי עוזר בזיהוי אך יש לציין כי חלק תקנים אלה מכילים סוכן צמצום וכי כאשר נעשה שימוש תחת אי – הפחתת התנאים הם עשויים להצביע משקולות מולקולריים שונים 9. אופציה היא לטעון MMP מסיס רקומביננטי על ג'ל זהה דגימות הבדיקה. MMPs עשויה להיות קשורה אך עם חלבונים אחרים, גרימת שינוי משקל מולקולרי לעין. מעכבי MMP סלקטיבי ניתן להוסיף ג'ל (או חלק לחתוך ג'ל במחצית) במהלך הדגירה של חיץ ככלים לפיתוח תרופתי זהות MMP של הטכניקה interest.A השני (המערבי כתם, immunocytochemistry, או ELISA) מומלץ עזרה בזיהוי של MMP של עניין. יצוין, כי מגבלות זיהוי כתמים המערבי הם לעתים קרובות נמוכים בהרבה מאלה של ג'לים zymographic, שעלול כדי שווא שלילי תוצאות בעת שימוש בטכניקה זו.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר ס 'רסלר (המחלקה לביולוגיה מולקולרית תאית, ביילור לרפואה) עבור מציע את השימוש של ריכוז החלבון כדי להגביר את ריכוז MMPs ב supernatants תרבית תאים.
פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מקרן קליפורד הגברת אלדר גרהם הלבן מחקר נתרמו ואת NIAMS NIH / (AR059838) ל CB. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
| Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
| Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
- Luo, J. The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex. Cerebellum. 4, 239-245 (2005).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors – diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Lagente, V., Boichot, E. Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases. J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).
- Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).
- Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin. Cancer Biol. , (2010).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochem. , 102-196 (1980).
- Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review. Biochimie. 87, 265-272 (2005).
- Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Biotechniques. 38, 73-83 (2005).
- Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).
- Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases. Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).
- Yu, W. H., Woessner, J. F. Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases. Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).
