Kombinera lipofila färgämne, På plats Hybridisering, immunohistokemi, och histologi

Summary

En kombination av olika tekniker för att maximera insamling av data från mus vävnad presenteras.

Abstract

Som går utöver enskilda geners funktion att skära djupare i genen regleringsnät kräver multipla mutationer kombineras i ett enda djur. En sådan analys av två eller flera gener behöver kompletteras med in situ hybridisering av andra gener, eller immunohistokemi av deras proteiner, både helt monterade utveckla organ eller avdelningar för detaljerad lösning av den cellulära och vävnad uttryck förändringar. Kombinera flera gen förändringar kräver att skapa eller flipase till villkorligt bort gener och undvika embryonala dödlighet. Krävs avel system ökar dramatiskt och kostnaden står i proportion till antalet muterade gener, med ett resultat av mycket få djur med hela repertoaren av genetiska önskade modifieringar. Amortizing den stora mängd arbete och tid för att få dessa få värdefulla exemplar som bär multipla mutationer kräver vävnad optimering. Dessutom undersöker ett enda djur med flera tekniker gör det lättare att korrelera brister gendeletion med uttryck profiler. Vi har utvecklat en teknik för att få en mer grundlig analys av ett visst djur, med förmåga att analysera flera olika histologiskt igenkännbara strukturer samt gen-och proteinuttryck alla från samma prov i båda monterade hela organ och sektioner. Även möss har använts för att demonstrera effektiviteten av den här tekniken kan tillämpas på ett brett spektrum av djur. För att göra detta kombinerar vi lipofila färg spårande, hela montera in situ hybridisering, immunohistokemi, och histologi att extrahera största möjliga mängd data.

Protocol

1. Lipofila Dye Injection Tissue Förberedelser: Alla vävnader dissektioner och manipulationer utförs på djur som fastställs i 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) med transcardial perfusion med peristaltiska pumpar med lämplig storlek nålar. Vävnaden kan lagras i 4% PFA i kylskåp i upp till 6 månader. Alla förberedelser och manipulationer bedrivs i 0,4% eller högre PFA tills montage med glycerol för avbildning. Detta belopp av PFA eliminerar effektivt RNaser och bevarar RNA för in situ hybridisering. Dye Förvaring: Alla färgämnen bör förvaras i en sluten mörkt utrymme för att minimera luftcirkulation och exponering för starkt dagsljus, eftersom de är ljuskänsliga. För att undvika korskontaminering, bör en separat uppsättning instrument användas för att hantera varje färgämne. Först måste en ansökan plats för färgen att väljas och främmande vävnad extraheras för att visuellt bekräfta den valda platsen, och tillträde för placering av färgen. Välja applicerats är det viktigaste steget i denna process. Att välja en bra plats att märka det neuronala befolkningen i fråga och inte främmande strukturer kan vara en utmaning. Noggrannheten för placering i en given tarmkanalen i visuell kontroll i dissekera tillämpningsområde kräver en viss nivå av förståelse av neuroanatomi i fråga. Dye kan antingen placeras centralt eller perifert att märka perifer eller central prognoser respektive som behövs för ett visst projekt (dvs hjärnan, perifera nerver, öra, öga). Lipophic färgämnen kommer att spridas i alla processer som tillhör en viss neuron, både retrogradely och anterogradely, fylla en viss nervcell eller alla nervceller som sticker ut i ett givet spår. NeuroVue färg från MTTI är förinstallerad på skyddsremsor för enkel applicering. Dye kan även lösas upp i 100% DMSO (arbete under huven) och tunna hår kan läggas i blöt i lösningen och därefter torkas för mindre applikationer. Den förinstallerade filterpapper färgämne skurna i lagom stora trekantiga bitar med microscissors. Storleken på färgen kommer att bero på storleken av provet, storleken av strukturen blir märkta och antal färger kan användas samtidigt. Var noga med att skära så litet av en bit som möjligt för att undvika märkning av andra strukturer. Efter att ha använt microsissors för styckning och pincett för hantering färgen agitera instrumenten i sprit för att avlägsna färg rester, sedan lufttorka helt, eller DAB med papper. Detta för att undvika att förorena provet med kvarvarande färg på instrument som kan etiketten oönskade strukturer. För insättning i mjuk vävnad såsom hjärnan filtret direkt kan infogas med hjälp av en punkt i filtret triangeln för att tränga igenom vävnaden. För mer styva vävnader göra ett snitt för att underlätta införandet av färg. Använd inte en dissekera nål för att driva filtret i vävnad. Detta kan orsaka felaktiga placering och störningar i vävnaden. Sätt alternativa våglängder NeuroVue färgämne som behövs för märkning av ytterligare neuronala populationer. Efter isättning av färg, och verifiera sin position, är prov placeras i en väl förslutna injektionsflaska med 4% PFA och inkuberas vid 36 ° C i mörker i 2-14 dagar beroende på ålder och spridning sträcka som skall täckas (ca 2 mm per dag vid 36 ° C). En dissekera räckvidd med epiflouresence kan användas för att bedöma om färgen har spritt till önskad plats, och provet kan placeras tillbaka i inkubatorn om spridningen bedöms vara otillräcklig. Med en vanlig dissekera räckvidd utan epifluorescene att upptäcka spridning att underskatta den verkliga längden färgen har spritt. Dessutom, om färgämnet koncentrationen är tillräckligt hög för att bedöma visuellt det kan orsaka absorption härdning vid användning släpps fluorescens. Den önskade vävnaden av intresse dissekeras ut och alltsammans monterat på en bild med glycerol och täckas för avbildning med en konfokalmikroskop. Konfokala inställningar som beskrivs i 1, 2. Om vävnaden storlek hämmar hela montering på en bild, är seriell sektionering behövs (se nedan). Mer information om beredning av vävnad för avbildning och färg spektrala egenskaper finns på: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf Figur 1. Schematisk översikt av experimentet. Örat är utsatt för att möjliggöra visualisering av alla strukturer. Lipofila färgämne är sedan injiceras och får diffusa. Efter spridning distinkta neuronpopulationer kan ses märkas av olika färgämnen. Nästa, in situ hybridisering (Sox2) utförs på örat och etiketter mRNA uttryck. Immunohistokemi sker sedan(Myo7, tubulin) att visualisera proteinuttryck. Följt av histologiska avsnitt där både in situ hybridisering och immunhistokemi kan visualiseras. 2. In situ hybridisering Om du vill börja med in situ hybridisering (varefter spårning med lipofila färgämnen kommer att vara omöjligt), se vävnad beredning i del 1. Varje tvätt, om inte anges, utförs med 2 ml lösning i rumstemperatur på en inverter / mixer. Var noga med att arbeta i en ren, RNas miljö. Torka och sedan rehydrera prov genom en graderad metanol serie. 100% 1 timme till över natten vid 4 ° C (tillval: förvara proverna vid -20 ° C i 100% metanol) 75% x 5 min. @ 4 ° C 50% x 5 min. @ 4 ° C 25% x 15 min. @ 4 ° C (eller tills vävnad sänkor) Överför proverna till ett 2 ml Eppendorf-rör (RNas gratis). Tvätta tre gånger i PBS (1x PBS) och slå hybridisering ugnen för framtida användning (60 ° C). PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Digest vävnad med 2 mikroliter av 20 mg / ml lager proteinas K (Ambion Katt # AM2546) i 2,0 ml färsk PBS. Faktisk PK koktiden beror på ålder av embryot. Följande är en grov uppskattning av tider. Uppslutning bör följas noggrant som deproteination är ett kritiskt steg. Under-rötning ger dålig sonden penetration medan över-rötning kommer att resultera i en förlust av strukturell integritet. En bra indikator på matsmältningen är en förändring i vävnaden från ogenomskinlig till nästan klar. Tabell 1. Proteinas K koktiden på musen vävnad. AGE (embryonala dag) Tid (minuter) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + Sluta matsmältningen genom att inkubera proverna i 4% PFA i 5 min. Tvätta i PBS. PBS x 1 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Kassera PBS särskild uppmärksamhet för att eliminera så mycket som möjligt. Prehybridize prover: Inkubera vid 60 ° C på omriktaren i 1,8 ml hybridisering blanda i minst 1 timme. Ställ IsoTemp värmeblock till 85 ° C för framtida bruk. Som en timme närmar sig, denaturera lax spermie-DNA (Invitrogen Cat No 15.632-011) genom inkubation vid 85 ° C i 10 min. Ställ på is tills det ska användas. Efter minst 1 timme prehybridization, tillsätt 200 mikroliter denatureras ssDNA och cirka 100 ng av DIG märkt riboprobe till varje prov. Hybridisera över natten vid 60 ° C i hybridisering ugn. Byt hybridisering blanda med 2 ml 2X SSC. Ställ IsoTemp värme block till 37 ° C och 70 ° C för framtida bruk. Tvätta med 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C i hybridisering ugn. Tvätta med 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C i hybridisering ugn. Tvätta med 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C i hybridisering ugn. Tvätta med 2X SSC x 60 min. @ 70 ° C i IsoTemp värmeblock. 70 ° C tar bort alla endogen alkalisk fosfatas aktivitet. Detta är kanske den mest betydande steg mot att minska bakgrund. Del (d) kan delas upp i två 30 min. tvättar för att minimera skador på vävnaden. Tvätta med PBS x 5 min. Tina RNas Ett enzym på is för framtida bruk. Byt PBS och tillsätt 1,0 mikroliter av RNas En Enzyme (Fermentas EN0531 10 mg / ml) x 60 min. @ 37 ° C i IsoTemp värmeblock (en 90 min. Inkubationstiden är att föredra om sonden är starkt koncentrerad). Kassera PBS / RNase A och tvätta fyra gånger. 1X tvättlösning x 10 min. 1X tvättlösning x 10 min. 1X tvättlösning x 10 min. 1X tvättlösning x 60 min. @ 70 ° C i IsoTemp värmeblock. Inkubera i 1X Block buffert för 1 timme. Vid denna tid, förbereda 2,0 ml blocket buffert och 1 mikroliter (1:2000) Anti-Digoxigenin antikropp per prov. Invertera kort och låt sitta vid 4 ° C fram till användning. Efter 1 timme kasta blocket buffert och tillsätt 2,0 ml i förväg upp blocket buffert + antikropp till prover. Inkubera över natten. Kasta blocket lösning. Tvätta med 1X tvättbuffert. 1X tvättbuffert x 5 min. 1X tvättbuffert x 5 min. 1X tvättbuffert i 1 timme x 5-6 förändringar. Tvätta med 1X tvättbuffert natten. Skölj med 1X detection buffert i 10 min. Överför proverna i detektion buffert väl plattan. Ta bort buffert och upptäcka med BM Lila (Roche 11442074001) tills önskad signalstyrka uppnås (med längre givare Detta kan innebära över natten). BM lila är ljuskänsligt täck med folie eller en låda. Blanda BM Lila väl före användning. Se till att proverna är flytande och inte fastnat i brunnarna. Kontrollera signal efter 1 timme. Skölj prover med 1X upptäckt buffert i brunnar x 5 min. Bild eller prover butik i 4% PFA vid 4 ° C. * Prover kan avbildas i detta skede och / eller efter immunohistokemi steg läggs till (del 3 nedan). Lösningar: Nukleasfritt fritt vatten: Blanda 1 ml DEPC (Sigma) med 1L sterilt ultrarent vatten. Autoklav. 1X PBS: Blanda 1 PBS paket (Sigma) i 1L nukleas fritt vatten och filtrera sterilisera. 1X tvättlösning: Blanda 450 ml nukleas fritt vatten + 50 ml 10x tvättlösning och filter sterilisera. Hybridisering Mix: 50% formamid volym (25 ml), 50% 2X SSC volym (25 ml), 6% dextransulfat av massan (3G). 1X Detection Buffer: Blanda 50 ml 10X upptäckt buffert med 450 ml nukleas gratis vatten och filtrera sterilisera. 1X Block Buffer: 5 ml 10X maleinsyra Buffer (Roche buffert har ett), 40 ml nukleas fritt vatten, 5 ml 10x Block buffert. 2X SSC: Blanda 50 ml 20X SSC med 450 ml nukleas gratis vatten och filtrera sterilisera. Graderad metanol: Späd 100% metanol med nukleas gratis vatten till 75%, 50% och 25% koncentrationer. 3. Immunohistokemi Steg 1 och 2 kan utelämnas om del 2 avslutades. I så fall se till att alla glycerol eller annan monteringsmedium tvättas bort. Observera att inte alla antikroppar fortfarande kommer att kunna upptäcka sina epitop efter proteinas K matsmältningen. Vi har en kort lista med antikroppar som kan användas i kombination med in situ hybridisering i däggdjur som de behåller sin specificitet (se tabell 2). Graderad etanol serien att befria vävnad av lipofila färgämnen (om inte färdig att genomföra i del 2):.. 50% etanol 5min, 70% etanol 5 min, 95-100% etanol över natten eller vid behov tills önskad effekt, 70% etanol 5 Min., 50% etanol 5min. Rehydrera genom att stegvis lägga till PBS i 5-10 minuter. Block vävnad för en timme hos 2,5% normal get serum (NGS) och 0,5% Triton X-100 @ RT på shaker. (01:01 5% NGS: 1,0% TritonX-100 i 1x PBS) Inkubera med primär antikropp (er) utspädd i block lösningen 48-72 timmar vid 4 ° C på shaker. Tvätta med PBS för 1 timme x 3 förändringar. Block som i steg 3. Inkubera med sekundär antikropp (er) utspädda i kvarteret lösning för 12-24 timmar vid 4 ° C på skakapparaten (Alexa Fluor ® färgämnen från Invitrogen användes). Tvätta som i steg 5. (Tillval:.. Disk fläcken med Hoechst kärnkraft fläck som första tvätten späda 10 mg / ml lager 1:2000 i PBS Följ med 1 tim tvättar i PBS x 2-3 förändringar @ RT på shaker) Imaging: Prover kan avbildas på detta steg med både transmission och epifluorescent mikroskopi, företrädesvis med hjälp av en konfokala imaging-system för ökad upplösning. För detta behöver vi rutinmässigt hela monterar öronen i glycerol med täckglas som distanser för att undvika över kompression av vävnaden. Utöver eller i stället för hela denna montera Imaging kan exemplar bäddas in i epoxiharts och seriellt sektioneras för extra histologisk detaljer. Att dra nytta av den kombinerade hela mount / avsnittet analys, undvika blekning av fluorescerande signalen i konfokala imaging steg. Lösningar Etanol lösningar: Späd 100% etanol i destillerat vatten till den slutliga koncentrationer på 50% och 70%. Blockera Lösning: 1:01 spädning 5% NGS: 1,0% TritonX-100 i 1x PBS (sista brukslösningar: 2,5% NGS, 0,5% TritonX-100). 1X PBS: Blanda 1 PBS paket (Sigma) i 1L destillerat vatten. 5% NGS: Tina 2,5 mL NGS och blanda med 47,5 ml 1x PBS. Förvaras vid 4 ° C. 1,0% TritonX-100: Blanda 49,5 mL 1x PBS med 0,5 ml TritonX-100 (tjänstledighet av shakern @ RT att blanda i 1 timme). Förvaras vid 4 ° C. Hoechst fläcken stamlösning: Lös upp 10 mg Hoechst färg per milliliter 1x PBS. Tabell 2. Antikroppar som arbetar med proteinas smälta K vävnad. Katt # Punkt Vender 25-6790 Anti-myosin-VIIA polyklonal Proteus Biosciences 25-6791 Anti-myosin-VI polyklonal Proteus Biosciences 9661 Klyvs caspase-3 polyklonal Cellsignalering T7451 Anti-Acetylerade tubulin Monoclonal Sigma PRB-238C Prox1 polyklonala Covance 4. Histologi Histologi kan införas efter del 1 för att öka upplösningen av lipofila färgämnet spårning i tjocka hela fästen som unga hjärnor eller efter avslutad del 2 eller 3. För seriell hjärnan sektioner rekommenderar vi Compresstome VF-700 mikrotom (Precisionary Instruments Inc., Greenville, North Carolina) för att erhålla ett enhetligt avsnitt tjocklek. Frysta snitt är mindre optimala på grund av ökad färga läckage under snittning processen 3. Beredning av seriella sektioner och montering i glycerol 4 är den metod som föredras av vävnad förberedelse när hela fästen eller fästen ytan inte tillåter tillräcklig visualisering av vävnad regioner av intresse. Vävnad kan också därefter inbäddade i epoxiharts och skär i 1-2 ìm tjocklek med hjälp av glas eller diamant knivar för TEM. När du använder denna teknik mest immunofluorescens kommer att kvarstå och är ännu mer stabil efter plast inbäddning, dock kommer alla lipofila spårning vara helt förlorad i detta skede som de löser sig i alkohol och epoxiharts. Var försiktig så proverna kommer att vara ljuskänslig tills de är inbäddade. För Compresstome VF-700 mikrotom sektionering, följa rekommendationerna i Precisionary Instruments Inc. Epoxy Bädda / Sektionering: Fästanordning: 2,5% gluteraldehyde / 1% PFA i 0,1 miljoner fosfatbuffert (pH 7,4) 1 timme till över natten. I ett glas prov injektionsflaska torka vävnad: 30% etanol (5min.), 50% etanol (5min.), 70% etanol (5min. till över natten), 95% etanol (5x 10min vardera.) Och absolut etanol (5x 10min . vardera). Övergångsbestämmelser Vätska: 01:01 absolut etanol: propylenoxid (PO) i 5 minuter. Lösningsmedel: PO bara 5x 10min. vardera. Infiltration med harts: 01:01 PO: harts övernattning på shaker. Häll lösning med prov (er) till platta bädda mögel och lämna på disken 4-6 timmar att avdunsta PO. Alternativt, ta bort locket injektionsflaska och lämna på shaker för 4 timmar (fungerar bra med större vävnad). Överför proverna till 100% harts för 4 timmar. Bädda in kåda i sista mögel med etikett. Polymerisera genom att inkubera vid 60 ° C i 24-48 timmar. Skär blocket med ett rakblad som behövs för att minimera yttre harts. Skär 1-2 um seriella avsnitt om en Ultramicrotome (en Ultracut E Reichert-Jung användes). Montera och bild med epifluorescent mikroskopi. Tillval: Stain en del av sektioner med histologiska fläckar (dvs. Stevenel blå) om så önskas (inser immunofluorescens inte kommer att upprätthållas i dessa avsnitt). Lösningar Etanol lösningar: Späd 100% etanol i destillerat vatten till 30%, 50%, 70% och 95% koncentrationer. Fixering lösning: Blanda 2,5 ml 50% Gluteraldehyde, 5 ml 10% paraformaldehyd, och 42,5 ml 0,1 M fosfatbuffert pH 7,4 (slutliga koncentrationer: 2,5% gluteraldehyde, 4% PFA). Förvaras vid 4 ° C. Epoxiharts: Gör enligt anvisningarna som medföljer Poly / säng 812 Embedding Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc. # 08.792-1). Förvara vid -20 ° C. 5. Representativa resultat Figur 2. Lipofila färg placering och bildbehandling i en mus embryo. Tre olika våglängd lipofila färgämnen injicerades och inkuberas att låta visualisering av trigeminusnerven (TN), glossopharyngeal nerv (GN) och vagusnerven (VN) centrala prognoser. A) lipofila färgämne placering i de perifera delarna av tre kranialnerver att tillåta spridning till hjärnstammen för visualisering av deras centrala processer. TN är märkt med NeuroVue Röd, GN: NeurVue Maroon, och VN: NeuroVue Jade. B) Samma mus som i (A) efter inkubation. Vissa diffusion kan ses med brightfield mikroskopi. C) Samma mus som i (A och B). Den hindbrain har dissekerat och platta monteras. Några märkning av de centrala processerna av den märkta tre nerver kan ses med brightfield mikroskopi. D) Confocal bilden av (C). Med användning av konfokala specifika nervceller kan ses, och användning av tre olika färgämnen gör för bedömning av fördelningen av varje population i förhållande till andra. Färgämnen var avbildade sekventiellt. NeuroVue Jade avbildades på en excitation av 488 nm och utsläpp 500-550 nm. NeuroVue Red avbildades på en excitation av 535 nm och utsläpp 550-600 nm. NeuroVue Maroon avbildades på en excitation av 643 nm och utsläpp på 650-700 nm. Figur 3. Schematisk översikt av experiment. Örat är utsatt för att möjliggöra visualisering av alla strukturer. Lipofila färgämneinjiceras sedan och får diffusa. Efter spridning distinkta neuronpopulationer kan ses märkas av olika färgämnen. Nästa, in situ hybridisering (sox2) utförs på örat och etiketter mRNA uttryck. Immunohistokemi sker sedan (Myo7, tubulin) att visualisera proteinuttryck. Följt av histologiska avsnitt där både in situ hybridisering och immunhistokemi kan visualiseras.

Discussion

I denna video visar vi en metod att kombinera fyra tekniker för att maximera datainsamling och sammanhållning genom att korrelera data inom ett visst djur (figur 3). Detta tillvägagångssätt kommer att minska mängden av avel och därmed tiden för att få publicerbara data samtidigt förbättra informationen om co-lokalisering och korrelat effekter av mutanter. Även om embryonala möss används i denna video, vuxen mus samt andra djur som kyckling, Xenopus och zebrafisk kan analyseras med hjälp av dessa tekniker också. När man använder andra arter proteinas K matsmältningen kan behöva ändras. Här använder vi olika fluorescerande NeuroVue färgämnen för att specifikt märke upp till tre neuronala populationer av intresse. Fördelen med dessa färgämnen är att de kan användas i muterade möss, vilket kan vara problematiskt när enbart förlita sig på immunohistokemi som kan eller inte kan påverkas av de mutationer som ska analyseras, och de etiketter nervceller retrogradely och anterogradely ^5. En färsk studie har också ökat antalet neuron populationer som kan märkas samtidigt till sex ^2. Efter kan lipofila färgämnet spåra samma vävnad av intresse sedan analyseras med hjälp av in situ hybridisering, för analys av gentranskription och kan därefter analyseras med hjälp av immunhistokemi för protein distribution. Den senare analysen kan kompletteras med detaljerade histologi som kan lägga till i fenotypen karakterisering ^6. Denna multifaktoriell analys har potential att vinna nya insikter genom korrelat analys inom samma djur som annars kan vara osannolika eller åtminstone i behov av mer omfattande protokoll och mus avel.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
in situ Hybridization:
PC DIG wash + block buffer set		Roche	1585762
Premix 20x SSC Buffer		Roche	1666681
Proteinase K 20mg/ml		Ambion	AM2546
Diethyl Pyrocorbonate (DEPC)		RPI	D43060
Formamide		Sigma	F9037
Dextran Sulfate		RPI	D20020
BM Purple		Roche	11442074001
Anti-Dig-AP Fab fragments		Roche	11093274910
RNase A enzyme 10mg/ml		Fermentas	EN0531
RNase Away		RPI	7003
Salmon Sperm DNA 10mg/ml		Invitrogen	15632-011
Stericup Filter Unit 0.22μm; 500ml		Millipore	SCGVU05RE
Filter Discs 0.2μm; 25mm		Whatman	6780-2502
Phosphate buffered saline PH 7.4 packets		Sigma	P-5368
Immunohistochemistry:
Goat Serum		Sigma	G9023
Triton X-100		Sigma	T8532
Hoechst Dye		Polysciences Inc.	9460
Histology:
Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit		Polysciences Inc.	08792-1
Propylene oxide		Sigma	110205
Gluteraldehyde Solution 50%		Fisher	G151
DPX Mountant		Fluka	44581
Rocker		MidSci	55D1114
Heat Block		Fisher	11-715-125D
Rotator		Thermo	400110Q
Incubator set to 60°		Fisher	11-690-625D
Dye tracing:
Microscissors		Geuder	G-19775
Fine Forceps		E.M.S	72680-F
NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade		MTTI	FS-100(1,2,6)
1X phosphate buffered saline (PBS)		Sigma	P-5368
Dissecting scope		Leica	M205 FA
Incubator set to 36°		Fisher	11-690-506DQ
Confocal Microscope		Leica	LSM 510
Slides		Surgipath	00240
Coverslips		Surgipath	00106
RPI		Glycerol	G22025-0.5
Paraformaldehyde (4% and 0.4%)		Fisher	T353-500