يصف هذا البروتوكول إجراء دراسة التنفس من الميتوكوندريا المعزولة من عضلات الهيكل العظمي. وقد تم تكييف هذا الأسلوب من Scorrano<em> وآخرون.</em> (2007). لإجراء العزل الميتوكوندريا يتطلب حوالي 2 ساعة. ويمكن الانتهاء من تنفس الميتوكوندريا في حوالي 1 ساعة.
Abstract
الميتوكوندريا هي عضيات السيطرة على حياة وموت الخلية. يشاركون في التفاعلات الأيضية الرئيسية ، تجميع معظم لاعبي التنس المحترفين ، وتنظيم عدد من الإشارات شلالات 2،3. وقد عزل الباحثون في الماضي والحاضر الميتوكوندريا من أنسجة الجرذان والفئران مثل المخ والكبد والقلب 4،5. في السنوات الأخيرة ، ركزت العديد من الباحثين على دراسة وظيفة الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي.
هنا ، نحن تصف الطريقة التي استخدمناها بنجاح لعزل الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي 6. إجراءاتنا يتطلب أن يتم إجراء كافة المخازن والكواشف الطازجة ويحتاجون لحوالي 250-500 ملغ من الهيكل العظمي والعضلات. درسنا الميتوكوندريا المعزولة من الساق الجرذان والفئران والحجاب الحاجز والعضلات خارج المقلة الفئران. ويتم قياس تركيز البروتين الميتوكوندريا مقايسة مع برادفورد. من المهم أن تظل عينات الجليد الميتوكوندريا الباردة خلال إعداد وتنفيذ الدراسات أن وظيفية في غضون فترة زمنية قصيرة نسبيا (~ 1 ساعة). ويتم قياس التنفس الميتوكوندريا باستخدام تخطيط الاستقطاب الكهربائي مع كلارك من نوع (Oxygraph النظام) عند 37 درجة مئوية 7. معايرة القطب الأكسجين هو خطوة أساسية في هذا البروتوكول ، ويجب أن يقوم عليها يوميا. الميتوكوندريا المعزولة (150 ميكروغرام) تضاف إلى 0.5 مل من العازلة التجريبية (EB). 2 حالة التنفس يبدأ مع اضافة الغلوتامات (5mM) ومالات (2.5 ملم). ثم ، يضاف ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP) (150 ميكرومتر) لبدء ولاية 3. يستخدم Oligomycin (1 ميكرون) ، ومانع سينسيز أتباز ، لتقدير الدولة 4. أخيرا ، الكربونيل السيانيد ف [trifluoromethoxy] هو المضافة فينيل هيدرازون (FCCP ، و 0.2 ميكرومتر) لmeasurestate 5 أو 6 uncoupled التنفس. ويتم احتساب نسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR) ، ونسبة 3 إلى حالة الدولة 4 ، بعد كل تجربة. يعتبر RCR ≥ 4 كدليل على مستحضر الميتوكوندريا قابلة للحياة.
باختصار ، نقدم طريقة لعزل الميتوكوندريا قابلة للحياة من عضلات الهيكل العظمي التي يمكن استخدامها في (مثل نشاط انزيم ، مناعي ، البروتيوميات ،) البيوكيميائية والدراسات الفنية (الميتوكوندريا التنفس).
Protocol
1. إعداد المخازن بدوره على 5804R الطرد المركزي وتعيين إلى 4 درجات مئوية. بدوره على حمام ماء Isotemp 3006D وتعيين إلى 37 درجة مئوية. إعداد الحلول التالية قبل العزلة العضلات : <li styl…
Discussion
نقدم بروتوكول لعزل الميتوكوندريا قابلة للحياة من عضلات الهيكل العظمي. إذا كان العائد هو المشكلة ، يمكن تعديل البروتوكول من قبل تفرخ في عضلة معزولة في 5 مل من PBS/10mM التربسين EDTA/0.01 ٪ لمدة 30 دقيقة في الجليد. لضمان إتمام عملية الهضم العضلات مع التربسين ، والعضلات تحتاج إلى …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للعيون (R01 EY12998) لاندرادي FH.