이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서 적응했다 외. (2007). mitochondrial 절연 절차는 약 2 시간이 필요합니다. mitochondrial 호흡은 약 1 시간에 완료할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Mitochondria 세포의 삶과 죽음을 제어 organelles 있습니다. 그들은 주요 신진 대사 반응에 참여, ATP의 대부분을 종합하고, 폭포 2,3 신호의 숫자를 조절. 과거 및 현재 연구는 간, 뇌 및 4,5 마음으로 쥐, 생쥐 조직에서 mitochondria 고립있다. 최근에는 많은 연구자들은 골격 근육에서 mitochondrial 기능을 공부에 집중했습니다.
여기서 우리는 골격 근육 6 mitochondria의 격리를 위해 성공적으로 사용한 방법을 설명합니다. 우리의 절차는 모든 버퍼와 시약은 신선했고 골격근의 250-500에 대한 MG 필요한 것을 요구합니다. 우리는 쥐, 마우스 gastrocnemius 및 격막으로부터 격리 mitochondria을 공부하고, 쥐 extraocular 근육. Mitochondrial 단백질 농도는 브래드 포드 분석과 측정됩니다. mitochondrial 샘플 준비 중 및 기능 연구가 비교적 짧은 시간 (~ 1 시간) 이내에 수행되어야 얼음처럼 차가운 유지하는 것이 중요합니다. Mitochondrial 호흡은 37 클라크 타입 전극 (Oxygraph 시스템) ° C 7 polarography를 사용하여 측정됩니다. 산소 전극의 교정이 프로토콜의 핵심 단계이며, 그것은 매일 수행되어야합니다. 절연 mitochondria는 (150 μg) 실험 버퍼 (EB)의 0.5 ML에 추가됩니다. 상태 2 호흡은 글루 탐 산염 (5mM)와 malate (2.5 ㎜)를 추가로 시작합니다. 그런 다음, 아데노신 diphosphate (ADP) (150 μm의)는 주 3 시작에 추가됩니다. Oligomycin (1 μm의), ATPase의 synthase의 차단은 주 4 추정하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 카르보닐 청산 가리 P - [trifluoromethoxy]이 - 페닐 - hydrazone (FCCP, 0.2 μm의)가 5 measurestate 추가하거나, 호흡 6 uncoupled입니다. 호흡 조절 비율 (RCR), 주 4 주 3의 비율은 각 실험 후 계산됩니다. RCR ≥ 4 가능한 mitochondria 준비의 증거로 간주됩니다.
요약, 우리는 생화학 (예를 들어, 효소 활동, 면역, proteomics) 및 기능 연구 (mitochondrial 호흡)에서 사용할 수있는 골격 근육에서 가능한 mitochondria의 분리를위한 방법을 제시한다.
프로토콜
1. 버퍼의 준비
- 원심 분리기의 5804R 켜고 4로 설정 ° C. 37 ° C.에 Isotemp 3006D 물 욕조와 세트를 켭니다
- 근육 분리하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- PBS : 증류수 (5 정제 / 리터)의 인산 버퍼 호수 (PBS) 정제를 디졸브. 잘 섞는다.
- PBS 추가로 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : 100 ML 솔루션을 준비하려면, PBS의 98 ML 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 ML를 추가합니다.
- 8X Mitochondria 버퍼 : 0.6의 최종 농도 M, 자유 지방산 400 MG에 대한 자당의 10.28 g 소 혈청 0.8 %의 최종 농도, 160 mm의 최종 농도에 대한 HEPES의 2.08 g, pH를위한 (BSA) 알부민 증류수로 50 ML에 7.4와 QS.
- 절연 버퍼 1 (IB1가) : 10-10 mm의 최종 농도, 0.392-215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 G, 8X mitochondria 버퍼, 산도의 1.25 ML 7.4 및 QS 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl 추가 증류수와 ML.
- 절연 버퍼 2 (IB2가) ....
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토론
우리는 골격 근육에서 가능한 mitochondria를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 수율에 문제가있는 경우, 프로토콜은 얼음에 30 분 PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 5 ML에서 분리된 근육을 잠복기로 수정할 수 있습니다. 트립신 완벽한 근육 소화를 확인하기 위해서는 근육이 완전히 다진해야합니다. 30 분 부화 후, PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 솔루션은 완전히 절연 버퍼 1 (IB1) 3 ML로 교체해야합니다. 또한, 트립신의 사용은 호흡 프로토콜 중 일부 mitochondrial 기판을 방해할 수 있습니다. 트립신을 사용하는 좋은 mitochondrial 준비에서이 프로토콜 결과에 사용된 모든 기판.
마우스 골격 근육 들어, 두 다리에서 gastrocnemius 근육을 결합하거나, 전체 다이어프램을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 쥐의 골격 근육 들어, gastrocnemius 또는 피임기구의 작은 부분 충분합니다. 과도한 근육 질량은 낮은 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 FH 안드레 이드하기 위해 국립 안과 연구소 (R01 EY12998)에서 부여에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 혼합 가스 | 지역 가스 공급업체 | ||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | |
| Bradford 단백질 정량 분석 키트 | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R 원심분리기 | Eppendorf | ||
| 압축 질소 | 지역 가스 공급업체 | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| 염화마그네슘 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 수컷 Sprague Dawley 랫드 | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge 소형 원심분리기 | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| 산소 전극 디스크 | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 소프트웨어 | Hansatech | ||
| pH 미터 | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| 염화칼륨 | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| 인산칼륨 | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem 균질기 | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0.0125mm × 25mm) 멤브레인 | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 드릴 프레스 | 철물점 | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
참고문헌
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S....
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재인쇄 및 허가
