Mitochondriale Isolatie van skeletspieren
Summary
Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van Scorrano<em> Et al..</em> (2007). Het mitochondriale isolatie procedure vereist ongeveer 2 uur. De mitochondriale ademhaling kan worden voltooid in ongeveer 1 uur.
Abstract
Mitochondriën zijn organellen beheersen het leven en de dood van de cel. Ze nemen deel aan de belangrijkste metabolische reacties, synthetiseren het grootste deel van de ATP, en regelen een aantal signaaltransductiecascades 2,3. Vroegere en huidige onderzoekers hebben geïsoleerd mitochondriën van ratten en muizen weefsels, zoals lever, hersenen en hart 4,5. In de afgelopen jaren, hebben veel onderzoekers zich op het bestuderen van de mitochondriale functie van de skeletspieren.
Hier beschrijven we een methode die wij met succes hebben gebruikt voor de isolatie van de mitochondriën van skeletspieren 6. Onze procedure schrijft voor dat alle buffers en reagentia zijn vers gemaakt en moet ongeveer 250-500 mg van de skeletspieren. We bestudeerden mitochondria geïsoleerd van rat en muis gastrocnemius en diafragma, en de rat extraoculaire spieren. Mitochondriale eiwit concentratie wordt gemeten met de Bradford assay. Het is belangrijk dat mitochondriale monsters worden bewaard ijskoud tijdens de voorbereiding en dat de functionele studies worden uitgevoerd binnen een relatief korte tijd (~ 1 uur). Mitochondriale ademhaling wordt gemeten met behulp van polarografie met een Clark-type elektrode (Oxygraph systeem) bij 37 ° C 7. Ijking van de zuurstof elektrode is een belangrijke stap in dit protocol en moet dagelijks worden uitgevoerd. Geïsoleerde mitochondria (150 ug) worden toegevoegd aan 0,5 ml van de experimentele buffer (EB). Staat twee ademhaling begint met toevoeging van glutamaat (5mm) en malaat (2,5 mm). Vervolgens wordt adenosine difosfaat (ADP) (150 uM) toegevoegd aan de staat 3 te starten. Oligomycin (1 uM), een ATPase synthase blocker, wordt gebruikt om de toestand 4 schatten. Ten slotte carbonyl cyanide p-[trifluormethoxy]-fenyl-hydrazon (FCCP, 0,2 uM) wordt toegevoegd aan 5 measurestate, of afgekoppeld ademhaling 6. De respiratoire controle ratio (RCR), de verhouding van toestand 3 naar toestand 4, wordt berekend na elk experiment. Een RCR ≥ 4 wordt beschouwd als bewijs van een levensvatbare mitochondria voorbereiding.
Kortom, presenteren we een methode voor de isolatie van levensvatbare mitochondria van de skeletspieren die kunnen worden gebruikt in de biochemische (bijvoorbeeld enzymactiviteit, immunodetectie, proteomics) en functionele studies (mitochondriale ademhaling).
Protocol
Discussion
We presenteren een protocol om levensvatbare mitochondria isoleren van skeletspieren. Wanneer de opbrengst een probleem is, kan het protocol worden gewijzigd door het incuberen van de geïsoleerde spier in 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% trypsine gedurende 30 minuten in het ijs. Te garanderen een volledige spier spijsvertering met trypsine, de spier volledig moet worden gehakt. Nadat de 30-minuten incubatie, moet de PBS/10mM EDTA/0.01% trypsine-oplossing volledig worden vervangen door 3 ml van isolatie buffer 1 (IB1). Daarnaas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Eye Institute (R01 EY12998) naar FH Andrade.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
References
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
