人类蛋白质组分析玻璃体元素剖析

Summary

该视频展示了一个区分和剖析各种半透明的人在验尸的眼睛玻璃体结构的有效技术。

Abstract

玻璃体是一个透明的，眼睛和覆盖在视网膜内的胶原细胞外基质，填充^，1,2之间的玻璃体子结构和视网膜的异常相互作用的基础玻璃体视网膜疾病，包括视网膜裂孔和脱离，黄斑皱褶，黄斑裂孔，年龄相关性黄斑变性，玻璃体黄斑牵引，增生性玻璃体视网膜病变，增殖性糖尿病视网膜病变，并继承vitreoretinopathies ^1,2玻璃体子结构的分子组成，是不知道。由于玻璃体是与有限的手术访问是透明的，它已经很难在分子水平上研究其子结构。我们开发了一种方法来分离和保存这些组织，蛋白质组学和生化分析。清扫技术在本实验视频演示如何隔离玻璃体基底部，前玻璃体，玻璃体的核心，从死后人类眼睛的玻璃体皮质。一维的每个玻璃体组件的SDS – PAGE分析表明，我们的清扫技术在四个独特的蛋白质图谱，对应于每个人的玻璃体下部结构。鉴定差异条块分割的蛋白质，就会发现潜在的各种玻璃体视网膜疾病的候选分子。

Protocol

1。眼前段解剖。 角膜是首先在角膜缘切口使用15 °刀片（图1）进入前室，中删除。然后一个弧形角膜巩膜剪刀的刀片插入前房。圆周削减是在角膜上，角膜缘前。 0.12科利柏钳和韦斯科特剪刀用于切割虹膜睫状体周前。 晶状体核与0.12科利柏钳或15 °刀片（supersharp）和钳皮层与胶囊被删除。 2。玻璃体核心的愿望。 一个23号针头，5毫升注射器插入中期玻璃体（图1）。 约1毫升或玻璃体核心是轻轻吸气。 样本，然后放置在离心管中，再放入液态氮。 3。前部玻璃体剥离。 通过调整入射光从鹅颈显微镜光前玻璃体被看作是一个半透明的戒指。前吸玻璃体核心分开便于识别的其他结构的前玻璃体。 弹性组织的表仔细拉到远离科利柏或敷料钳睫状体和切Vannas剪刀。这一演习是重复的。 样本，然后放置在离心管中，再放入液态氮。 4。玻璃体基底部夹层。 使用0.12钳稳定眼罩，韦斯科特剪刀用“花”的眼睛，使四个等距的减压削减对视神经头睫状体。 睫状体平坦（图2）蚌是从每个象限使用韦斯科特剪刀。 玻璃体基底部，然后抓住钳在玻璃体和视网膜（图2）锯齿缘两侧。 玻璃体基底部的持续牵引，应用镊子。韦斯科特剪刀连续切割提取“珍珠串”的外观，半透明的组织，因为它是切除。 样本，然后放置在离心管中，再放入液态氮。 5。玻璃体皮质去除。 韦斯科特剪刀每个象限切除玻璃体切割后的锯齿缘（图2）单张约3毫米。 组织之间的传单，玻璃体皮质可视化的半透明膜。 0.12钳或弹性薄膜是抓住坚持一个Weck – CEL手术海绵举行。然后拉到远离视网膜玻璃体皮质韦斯科特剪刀（图1）切除。 样品放置在离心管中，再放入液态氮。所有样本保存于-80℃直至实验利用。 6。代表性的成果组织样本，可以处理各种具体的实验方法。在我们的例子中，样品进行蛋白质分析提交经SDS – PAGE（图3）。 图1。横断面人眼玻璃体描绘不同的子结构，最前部玻璃体是一个薄的胶原层，被称为前玻璃体。玻璃体核心包括整个中部地区的玻璃体。这部分的玻璃体是对比，这是足够的粘性，要把握钳和牢固地附着在底层的睫状体和视网膜玻璃体基底部的水。涵盖玻璃体的核心是一个非常薄的的称为玻璃体皮质的胶原外壳。 图2。玻璃体基底部的解剖结构。玻璃体基底部是沿锯齿缘（白色箭头），这是政企分开，睫状体和视网膜的分界线位于玻璃体半透明的下层结构。玻璃体基底部前缘延伸至睫状体玻璃体（白线）。玻璃体基底部后缘延伸2 – 3毫米，后到锯齿缘（白色虚线）。切除玻璃体基底部，镊子是用来把握组织和拉动了从底层的睫状体和视网膜。一旦升高，韦斯科特剪刀用于切割沿基地。 图3。一维玻璃体元素SDS – PAGE前玻璃体总蛋白的浓度，玻璃体基底部，维生素reous核心，玻璃体皮质分别为11.24，20.1，16.61，14.24毫克/毫升，分别。在200千伏为45分钟，凝胶电泳，染色与火烈鸟（BIO – RAD），和可视化使用VersaDoc成像系统（BIO – RAD）。为不同组织的剖面显示几个类似的乐队，说明无论是保守或交叉污染的蛋白质，以及独特的频带（星号），表明不同的本地化的蛋白质。

Discussion

玻璃体是一个半透明的凝胶，其分子组成是知之甚少，特别是在其子结构水平，玻璃体基底部的核心，皮质和前玻璃体。玻璃体核心包含胶原第二，第五，第九和第十一，，随着硫酸软骨素蛋白多糖，乙酰肝素硫酸蛋白多糖和透明质酸^1,2蛋白质生物标志物在玻璃体核心疾病，如糖 ​​尿病性视网膜病变相关^。3-5如何在每个子结构，这些蛋白质差异表达的特定蛋白质的身份，在很多情况下是不知道。这些细节可能会了解与特定的玻璃体视网膜疾病相关的蛋白质的来源，并帮助目标未来疗法。虽然尚未确定最佳组织解剖验尸间隔，蛋白质的降解可能影响下游实验。例如，免疫组织化学是在12小时死后眼睛的影响，一些特定的酶的活动可能会在几个小时内减少（未发表观察）。在这项研究中所有的组织，收集死亡的2至8小时，没有发生重大变化蛋​​白表达或适合蛋白质组学analsyis。液氮冷冻法保存超过固定选择，以防止蛋白质结构中的小变化引起的固定液的交联，已在其他组织中表现出的LC-MS/MS。蛋白质组学研究将取决于准确的能力剖析玻璃体不同的车厢，在这个视频的实验表明。我们已经证实的解剖技术，使用一维的SDS – PAGE。由于我们的研究结果表明，玻璃体中的各种子结构有差异表达的蛋白质。确定这些蛋白质会提供更详细地了解了玻璃体条块分割。

Materials

Name	Company	Catalog Number
0.12 forceps	Storz Ophthalmics	E1502
5-cc syringe	Becton-Dickinson	309603
Straight Dressing Forceps With Serrations	Storz Ophthalmics	E1400
23 gauge needle	Becton-Dickinson	305145
Colibri forceps	Storz Ophthalmics	2/132
Castroviejo angled corneal scissors	Storz Ophthalmics	E3223
Vannas Curved Capsulotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3387
Weck-Cel surgical spears	Medtronic	0008680
Westcott Curved Tenotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3320