Method Article

Proteomic 분석을위한 인적 유리 바디 요소의 해부

DOI:

10.3791/2455

⸱

January 23rd, 2011

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Omics Laboratory, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 동영상은 사후의 눈에 인간의 유리 신체의 다양한 반투명 구조를 차별하고 해부를위한 효과적인 기법을 보여줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유리체는 안구와 overlies 망막의 내부를 채우고 광학 명확 collagenous 세포외 기질이다. 유리체 substructures와 망막 사이에 1,2 비정상적인 상호 작용은 망막 눈물과 분리, 황반 주름, 황반 구멍 등 여러 vitreoretinal 질환, 기초 연령 관련 황반 변성, vitreomacular 트랙션, proliferative vitreoretinopathy, proliferative 당뇨성 망막 병증의 및 상속 vitreoretinopathies. 1,2 유리체 substructures의 분자 구성을 알 수 없습니다. 유리체 시체가 제한된 수술 액세스할 수있는 투명하기 때문에, 그것은 분자 수준에서 그 substructures을 공부하기 어려운되었습니다. 우리는 proteomic 및 생화 학적 분석을 위해 이러한 조직을 분리하여 보존하는 방법을 개발했습니다. 이 실험 동영상 해부 기술은 유리 기지 앞쪽에의 hyaloid, 유리 코어, 그리고 사후에 인간의 눈에서 유리 피질을 분리하는 방법을 보여줍니다. 각 유리체 구성 요소 중 하나는 차원 SDS - PAGE 분석은 우리의 해부 기술은 인간의 유리 본체의 각 기초 공사에 해당하는 사 고유의 단백질 프로파일 결과 것으로 나타났다. differentially들에게만 단백질의 식별이 후보 분자는 다양한 vitreoretinal 질병을 기본 공개합니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 앞쪽에 세그먼트 해부.

  1. 각막은 먼저 15 ° 블레이드 (그림 1)를 사용하여 앞쪽에 챔버에 limbus에서 절개하여 제거됩니다. 다음 곡선 각막 - scleral 가위 중 하나 블레이드는 앞쪽에 챔버에 삽입됩니다. 서컴프렌셜 인하는 limbus 단 앞쪽에, 각막에 만들어집니다.
  2. 0.12 콜리 브리 포셉 및 웨스트컷 가위는 모양체에 circumferentially 앞쪽에 아이리스 절단하는 데 사용됩니다.
  3. 렌즈 핵은 0.12 콜리 브리의 포셉 또는 15 ° 블레이드 (supersharp)와 포셉와 피질과 캡슐로 제거됩니다.

2. 유리체 핵심 흡인.

  1. 5 CC의 주사기에 23 게이지 주사 바늘을 삽입하는 중간 유리 (그림 1).
  2. 약 유리체 코어 1 ML 이상 부드럽게 aspirated입니다.
  3. 예제는 다음 microfuge 튜브에서 다음 액체 질소에 배치됩니다.

3. 앞쪽에 Hyaloid의 해부.

  1. 앞쪽에 hyaloid은 구스 넥 현미경 조명의 입사 광을 조정하여 반투명 링으로 여겨진다. 유리체 핵심 이전 열망은 쉽게 식별을위한 다른 구조에서 앞쪽에 hyaloid를 분리합니다.
  2. 탄성 조직의 시트는 신중하게 콜리 브리 또는 드레싱 포셉와 모양체에서 끌려나와 Vannas 가위로 절단됩니다. 이 책략이 반복됩니다.
  3. 예제는 다음 microfuge 튜브에서 다음 액체 질소에 배치됩니다.

4. 유리체베이스 해부.

  1. 아이 컵을 안정화시키기 위해 0.12 집게를 사용하여 웨스트컷 가위는 시신경의 머리를 향해 모양체에서 네 개의 동등 간격 스트레스 덜어 인하함으로써 "꽃"눈에하는 데 사용됩니다.
  2. 모양체 (그림 2)의 갈 거예요의 plicata는 웨스트컷 가위를 사용하여 quadrants 각에서 제거됩니다.
  3. 유리체 기지를 다음 갈 거예요 플라나과 망막 (그림 2)을 통해 포셉로 오라 세라타의 양쪽에 파악됩니다.
  4. 유리체 기지에 지속적인 견인이 집게와 함께 적용됩니다. 가 excised 그대로 웨스트컷 가위로 연속 절삭은 "진주의 문자열"모양과 반투명 조직을 추출합니다.
  5. 예제는 다음 microfuge 튜브에서 다음 액체 질소에 배치됩니다.

5. 유리체 접속 제거.

  1. 갈 거예요 플라나은 오라 세라타 (그림 2) 사후 약 3 mm 전단지를 절단하여 웨스트컷 가위로 quadrants의 각 excised 수 있습니다.
  2. 조직 전단지 사이에 유리체 피질은 세미 투명 필름 시각이다.
  3. 탄성이 영화는 중 0.12 포셉로 파악 또는 샌드위치 - 셀 수술 스펀지을 준수하여 개최됩니다. 유리체 피질은 다음 떨어진 망막에서 가져온 및 웨스트컷 가위 (그림 1) excised 수 있습니다.
  4. 샘플은 microfuge 튜브에서 다음 액체 질소에 배치됩니다. 모든 샘플은 실험을 위해 활용 -80 ° C까지에 저장됩니다.

6. 대표 결과

조직 샘플은 특정 실험을위한 다양한 방법으로 처리할 수 있습니다. 우리의 경우, 샘플은 SDS - PAGE (그림 3)에 의해 단백질 분석에 제출했다.

figure-protocol-1
그림 1. 인간의 눈의 횡단면보기 유리체 신체의 다른 substructures을 묘사한. 가장 앞쪽에 유리가 얇은 collagenous 층 앞쪽에 hyaloid라고합니다. 유리체 코어는 유리 몸 전체 중앙 지역을 구성되어 있습니다. 유리체의이 부분은 집게로 파악되어야하고 단단히 기본 모양체와 망막에 첨부되어 충분한 점성있는 유리 기지에 대비 더 수성이다. 유리체 코어를 포함한 것은 유리체 피질이라고하는 매우 얇은 껍질 collagenous입니다.

figure-protocol-2
그림 2. 유리체 기본 해부학. 유리체베이스 모양체와 망막을 분리 나누어 줄 수있는 오라 세라타 (흰색 화살표)를 따라 위치한 유리 신체의 반투명 지하입니다. 유리체 기지의 앞쪽에 경계선은 모양체의 갈 거예요 플라나 (흰색 라인)을 통해 확장됩니다. 유리체 기지의 사후 경계선 오라 세라타 (흰색 대쉬)로 사후 2 - 3 - mm를 확장합니다. 소비세에 유리 기지, 포셉는 조직을 파악하고 기본 모양체와 망막에서 멀리 당겨하는 데 사용됩니다. 일단 고가, 웨스트컷 가위는 기지를 따라 절단하는 데 사용됩니다.

figure-protocol-3
그림 3. 앞쪽에 hyaloid에 대한 한 차원 유리 바디 요소의 SDS - PAGE. 총 단백질 농도, 유리 기지, VITreous 코어 및 유리체 피질은 각각 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 MG / ML,했다. 젤 전기 영동은 플라밍고 (바이오 래드) 물들일, 45 분 200 KV에서 수행하고 VersaDoc 이미징 시스템 (생물 래드)를 사용하여 시각되었습니다. 다른 조직에 대한 프로파일 differentially화된 단백질을 나타내는 (별표) 보존 또는 단백질 교차 오염뿐만 아니라, 독특한 밴드 중 하나를 나타내는 몇 가지 유사한 밴드를 보여줍니다.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유리체베이스, 코어, 피질, 그리고 앞쪽에 hyaloid : 유리 몸은 누구의 분자 구성이 저조한 특히 substructures의 수준에서 이해 반투명 젤입니다. 유리체 핵심은 당뇨 망막 병증과 같은 질환과 연관된되었습니다 콘드로이틴 황산염의 proteoglycans, heparan의 황산염의 proteoglycans와 유리체 핵심에 hyaluronan. 1,2 단백질 생체와 함께, 콜라겐으로 합성한 II, V, IX, 그리고 XI가 포함되어 있습니다. 3-5 어떻게 이러한 단백질은 differentially substructures 각 표현하고 있으며, 많은 경우에 특정 단백질 신원은 알려져 있지 않습니다. 이러한 내용은 특정 vitreoretinal 질환과 관련된 단백질의 기원에 대한 통찰력을 제공하고 대상 미래 요법을하는 데 도움이 될 수 있습니다. 조직의 절개에 대한 최적의 해부 간격이 결정되지 않았지만, 단백질이 저하 하류 실험에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, immunohistochemistry 12 시간 사후 눈에 영향과 일부 특정 효소 활동 (관찰되지 않은) 몇 시간 이내에 줄어들 수 있습니다. 이 연구의 모든 조직은 proteomics의 analsyis을위한 단백질 표현이나 적합성에 큰 변화없이 사망 2, 8 시간 사이에 수집되었다. 보존의 액체 질소 동결 방법이 LC-MS/MS 다른 조직에서 증명되었습니다 정착액 상호 연결로 인한 단백질 구조의 작은 변화를 방지하기 위해 고정 이상 선택합니다. 6 Proteomic 연구 정확하게하는 능력에 따라 달라집니다 본 동영상 실험에서 보여주 유리체의 다른 구획을 해부하다. 우리는 1 차원 SDS - PAGE를 사용하여 절개 기술을 입증했습니다. 우리의 결과는 제안으로, differentially 다양한 유리 바디 substructures에 단백질이 표현됩니다. 이러한 단백질을 확인하는 것이 유리 compartmentalization의 자세한 이해를 제공합니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기금은 시력을 위해 전투에 의해 제공되었다. 조직은 아이오와 라이온스 안구 은행에서 얻은되었습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
이름 회사 카탈로그 번호
0.12 포셉 Storz Ophthalmics E1502
5 CC 주사기 백톤 디킨슨 - 309603
톱니 모양의 스트레이트 드레싱 포셉 Storz Ophthalmics E1400
23 게이지 바늘 백톤 디킨슨 - 305145
콜리 브리 포셉 Storz Ophthalmics 132분의 2
Castroviejo 직각 각막 가위 Storz Ophthalmics E3223
Vannas 곡선 Capsulotomy 가위 Storz Ophthalmics E3387
샌드위치 - 셀 외과 스피어스 메드 트로닉 0,008,680
웨스트컷 곡선 Tenotomy 가위 Storz Ophthalmics E3320

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).">Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
  2. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).">Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).
  3. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).">Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
  4. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).">Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
  5. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).">Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
  6. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).">Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vitreous Body DissectionHuman Vitreous AnalysisVitreous Substructure IsolationProteomic Analysis TechniqueSDS PAGE AnalysisAnterior Hyaloid DissectionVitreous Base IsolationVitreous Cortex SeparationVitreous Core AspirationPostmortem Eye Dissection

Related Articles