Summary

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

Published: January 11, 2011
doi:

Summary

このビデオプロトコルは、胚14日目マウスの脳の神経節隆起から神経幹細胞の単離と拡大のためのニューロスアッセイのアプリケーションを示しています。

Abstract

哺乳類では、幹細胞は、動物の寿命の間にさまざまな組織や器官の細胞の起源と更新を維持するために未分化細胞のソースとして機能します。彼らは潜在的に老化の過程で、または負傷し、疾病の過程で失われた細胞を置き換えることができます。神経幹細胞(NSC)の存在が最初の小説、無血清培養系を用いて成体哺乳類の中枢神経系(CNS)、ニューロスフェアアッセイ(NSA)にレイノルズとWeiss(1992)によって記述されていた。このアッセイを使用して、それは胚の中枢神経系のさまざまな地域からのNSCを分離し、拡大することも可能です。 in vitroでの拡張のNSC これらは多能性であり、中枢神経系の三大細胞型を生じさせることができる。 NSAが実行するのが比較的簡単に思えますが、信頼性と一貫性のある結果を達成するために必要とされるここで示す手順に注意が必要です。このビデオでは、実質的にNSAは、胚性14日目マウスの脳組織からのNSCを生成し、拡大を示し、1つが再現可能なニューロスフェア培養を達成できるように技術的な詳細を提供します。手順は、単一の細胞懸濁液を得るために神経節隆起、NSCの培地で収穫した組織の解離を収穫するために、脳の顕微解剖をE14マウス胚を収穫し、最終的にNSAの培養中の細胞をプレーティングが含まれます。文化の中で5〜7日後、得られた一次ニューロスフェアは、さらに将来の実験のためのNSCの数を拡大して継代されています。

Protocol

1。基本的には、解剖に進む前に設定します。 完全なNSC媒体の適切な量はそれぞれ、9:1の比率でNeuroCult NSC基礎培地とNeuroCult NSC増殖サプリメントを混合して調製される。 培地は37℃の水浴で暖めています。 抗生物質の高濃度(10%)とコールドHEPES緩衝最小必須培地(HEM)は、解剖や洗浄を目的として作成されています。また、抗生物質の補充とNSC基礎培地はまた、この?…

Discussion

ニューロスフェアのアッセイは、そのシンプルさと再現性の神経幹細胞1-5の分離と拡大のための選択の方法です。このアッセイは、in vitroおよびin vivo試験の両方に使用できる未分化のCNS ​​前駆細胞、の大規模な世代のための貴重なツールです。それは、ニューロスフェアは、善意の神経幹細胞とより限定された前駆細胞の両方から生成することができることが強調さ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、オーバストリート財団からの資金によってサポートされていました。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700  
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701  
%0.05 trypsin-EDTA Reagent Gibco 25300-062  
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma T6522  
Pen/Strep Reagent Gibco 15140-122  
*MEM Reagent Gibco 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma H4034 HEM component
*Distilled water Reagent Gibco 15230-147  
Cell strainer Sieve BD Falcon 352340  
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196  
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905  
15 ml tubes Culture ware BD Falcon 352096  
50 ml tubes Culture ware BD Falcon 352070  
Fine curved forceps Surgical tools Fine Science Tools 11251‐35  
Small fine forceps Surgical tools Fine Science Tools 11272‐30  
Small forceps Surgical tools Fine Science Tools 11050‐10  
Fine scissors Surgical tools World Percision Instruments, Inc. 500216  
EGF Growth factor R&D 2028-EG  
b-FGF Growth factor R&D 3139-FB  
Heparin Growth factor Sigma H4784 Reconstituted in PBS

*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

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Cite This Article
Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457, doi:10.3791/2457 (2011).

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