Разработка пользовательских яичника китайского хомячка, клетки-хозяина белка Анализы использованием Акустические технологии, микрочастицы Мембранные

Summary

Развитие пользовательских тестов на платформе ViBE для более чувствительны, воспроизводимы, автоматизированные результаты в сложных матрицах описывается. Картридж универсальный позволяет анализы, чтобы быть легко адаптированы для использования с помощью пользовательских тестов. Такая универсальность позволяет быструю разработку и проверку новых анализов или автоматизированные версии существующих ручных тестов, примером в этом видео.

Abstract

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale’s proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.

An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale’s biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.

To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.

Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Protocol

1. Подготовка микрочастицы Этикетка Антитела использованием биотина NHS химии Определение степени биотинилирование Конъюгата стрептавидин Бусины с биотинилированных антител Ресуспендируют бисером в оригинальном флаконе на вортексе в течение 1-2 минут Алиготе желаемый объем из бисера в микроцентрифужных трубки Вымойте бисером 3 раза PBST: Место трубку с бисером на магнит в течение 2 минут Удалить супернатант аспирацией с трубки на магнит. Будьте осторожны, чтобы не нарушить бисером Снимите трубку от магнита и добавьте 1 мл PBST Vortex в течение 20 секунд для ресуспендирования бисером Центрифуга в течение 5 секунд, чтобы удалить бусы из крышки Повторите 2.3.1-2.3.5 в два раза больше После третьего места мыть труба на магните и аспирации PBST Добавить биотинилированного антитела к бисером и ресуспендирования При необходимости довести объем биотинилированного антитела до 300 мкл с PBS. Если антитела объем уже превышает 300 мкл не добавляйте PBS Инкубируйте шарик / антитело подвески в течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере или вихревой трубки ротатор Промыть 3 раза PBST, как в шаге 3. Блок бусин с BSA биотинилированного После третьего мытья добавить 10 мкг / мг биотинилированного BSA, регулировать громкость до 300 мкл с PBS в случае необходимости, и инкубировать при перемешивании в течение 30 минут Промыть 3 раза PBST как в шаге 3 Ресуспендируют бисером в 100 мкл PBS/0.05% BSA. Азид натрия может быть добавлен для длительного хранения Используя стандартные NHS Fluorescein протоколов, fluoresceinate детектор антител Определить степень Fluorescination 2. ГПУ – Разработка Подготовка рабочих растворов: Fluorescein меченых антител (П-Ab): Большинство СНО-ГПУ анализов использования П-Ab в конечной концентрации 400 нг / мл. П-Ab добавляется ¼ конечного объема теста, поэтому концентрация рабочего раствора составляет 1,6 мкг / мл. Подготовка этого решения путем разбавления вялые мускулы акции с BioScale бисера / вялые мускулы разбавителя. Бисер: Большинство СНО-ГПУ анализов используют бисер в конечной концентрации 2х10 5 бусин / мл. Бусинка реагента составляет ¼ от конечного объема анализа, поэтому концентрация рабочего раствора 8×10 5 бусин / мл. Подготовка этого решения путем разбавления бусинка акции с BioScale бисера / вялые мускулы разбавителя. Vortex шарик фондового хорошо, чтобы убедиться, что все бисер во взвешенном состоянии до удаления аликвоту. Запуск буфера: состав работает буфер, возможно, придется быть оптимизированы для антител использованы для разработки анализа, однако несколько СНО-ГПУ тесты были разработаны с использованием 10 мМ HEPES буфера, 1% Tween, рН 7,5. BioScale разработала добавку для работы буфера (поставляется с Development Kit), который добавляется в буфер для концентрации 1% до использования. Развести калибраторов и образцов с BioScale раствора для разведения образцов. 3. ViBE Система Настройка Включите Workstation ViBE на Подключение системы водоснабжения и сточных Премьер системы Вставьте картридж ViBE Маршрут трубы Подготовка анализа шаблонов, заполняя лист с надписью "Пример Setup". BioScale предоставляет возможность иметь один шаблон анализа для каждого анализа Workstation Vibe. Это позволяет пользователю редактировать и сохранять конкретные замечания в "Записках" лист шаблон для различных анализов соответствии полную запись эксперимента. Первоначальный анализ шаблонов в рабочем состоянии: Начните с заполнения таблицы (левый верхний угол) в диапазоне концентраций стандартов в анализе в "Пример установки" листа. Затем введите дополнительную информацию в таблице справа от стандартов (Simple Колонка Прочитано установки Один Добавить реагентов и два реагента Добавить установок) поручить рабочей станции ViBE как долго образцы необходимо инкубировать, сколько объема реагента должно быть передано , как долго образец накопления должна быть, и является ли кондиционирования датчика и обеззараживания проб и картридж необходимо, и т.д. Заполните пластины макета. Нагрузка выборки / реагентов в пластинах. ViBE обеспечит необходимые объемы для реагента пластины. Объем образца может варьироваться, но в половине общего объема анализа в 120 мкл хорошей отправной точкой. Применение пластин крышками. Нагрузка пластин на рабочей станции палубе. Выполнить анализ запуска мастера, пройти мастер и начать анализ. 4. Представитель Результаты Рисунок 1: AMMP Сэндвич иммуноферментный </p> На рабочей станции Vibe, анализ AMMP меры концентрации антигена. Сигнал измеряется, когда шарик-антиген-антитело связывается гаптена к датчику через гаптен / анти-гаптен взаимодействия. Регенерация приносит датчика к началу состояние путем удаления иммунных комплексов. Рисунок 2: СНО-ГПУ AMMP Пробирной калибровочной кривой Рисунок 2 выше, является примером СНО ГПУ AMMP калибровочной кривой анализа. Анализ может быть выполнен в пробах, взятых по очистке потока, включая реактор с высокой точностью и воспроизводимостью. Рисунок 3: Белки AMMP калибровочной кривой Пробирной На рисунке 3 калибровочной кривой для остаточного белка AMMP Анализ, выполненный с VIBE остаточного белка Пробирной Kit. Же комплект может быть использован для быстрого определения на 30 минут инкубационного периода, или на более чувствительных результатов и более широкий динамический диапазон с более длительным инкубационным периодом без потери точности и точности, оба из которых, как правило, лучше, чем эквивалентные ИФА в пользователей руки Рисунок 4: Продукт Титр AMMP Пробирной Рабочая станция ViBE также может быть использован для анализа продуктов Титр, результаты, показанные на рисунке 4. Исполняет иначе, чем другие анализы AMMP, это анализ не требует обработки проб, кроме простой разбавления, или бусы, и количественного была проверена в "без отжима" образцов, содержащих более 10 миллионов клеток в широком диапазоне viabilities. Рисунок 5: AMMP Пробирной стандартной кривой для GST-Gadd34 биомаркеров анализа Показанный на рисунке 5 является стандартной кривой сигнал, получаемый путем ViBE BioAnalyzer (панель) или AlphaScreen технологии с использованием рекомбинантной GST-Gadd34. Результаты на платформе ViBE были примерно журнал более чувствительными используя те же антитела. AMMP использует измерение меньше крупных частиц и все же выгоды от решения фазы захвата и формирование обнаружения комплекса. Рисунок 6: AMMP Пробирной стандартной кривой для GST-Gadd34 в опухолевых образцов На рисунке 6 индукции Gadd34 от CWR22 ксенотрансплантаты был испытан в наличии или отсутствии boronate протеасомы ингибитора, как проанализированы либо ViBE BioAnalyzer (панель) или AlphaScreen (Группа B). Платформа ViBE был способен производить чувствительный, воспроизводимых результатов в естественных условиях в опухоли ксенотрансплантаты в то время как сигнал AlphaScreen гасили с повышенным мкг белка. Этот пример показывает силу AMMP технологии в очень сложных образцов. Благодаря чувствительным чипом обнаружения и высокой эффективности магнита вблизи чипов, низком количестве магнитных микрочастиц может эффективно и воспроизводимо мусор для низких целевых изобилии среди сложности лизировали сотовой связи (в том числе лизис реагентов) и крови мусора.

Discussion

Приведенные примеры демонстрируют AMMP высоко чувствительные количественные результаты в сложных образцов. Этот спектакль, когда поставляется с легкостью и управления форматированием реагентов в системе позволяет для различных приложений. Эти приложения могут быть специфическими для мишени, как в Gadd34 в опухоль, или общие для целого спектра задач, как в клетке-хозяине обнаружения белка и количественное определение в образцах, которые пересекают очистки потока. Низкие платформы ViBE накладных в сочетании с очень гибким AMMP предоставляет мощный инструмент для проведения важных анализов.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads		BioScale		(10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes		New England BioLabs	cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent		BioScale		to dilute beads and FlAb
Sample Diluent		BioScale		to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive		BioScale