含新生肽- tRNA的核糖体的生化分析的一个主要障碍已被其他核糖体的存在,在同一样品的核糖体不参与翻译的特定基因序列分析。我们制定了一个简单的方法,净化,完全包含利益的新生肽酰- tRNA,核糖体。
近日,有详细的结构和生化研究许多在新生肽合成抗生素抑制蛋白质的合成过程中,发生在核糖体的分子事件。这些抗生素,大多在形成肽- tRNA的监管新生多肽,抑制要么肽键形成或翻译终止1-7。抑制这些事件可以阻止核糖体的运动,这种现象被称为“翻译逮捕”。抗生素或新生肽诱导的翻译逮捕已被证明,以规管在不同的细胞,如细 胞生长,抗生素耐药性,蛋白质易位和细胞的新陈代谢8-13功能有关的基因的表达。如果我们要了解完整的核糖体在翻译的作用,在每一个有机体,抗生素和监管新生多肽如何改变核糖体的功能的知识是必不可少的。
在这里,我们描述了一个简单的方法,可用于净化,专门分析,这些核糖体的翻译一个特定的mRNA,并包含一个特定的肽酰- tRNA 14。这个程序是基于绑定到一个生物素标记的mRNA翻译的核糖体的选择性分离。这些翻译的复合物是分开相同的混合物中的其他核糖体,采用链霉亲顺磁性珠(SMB)和磁场(MF)。合成生物素标记的mRNA为模板,PCR产生的DNA片段,含有T7转录促销员决胜转录使用检测。 T7 RNA聚合酶结合生物素UTP生物素- 16 – UMP;我们的条件下,约10个生物素- 16 – UMP分子纳入600 NT 25%的人民运动联盟的内容表达。这些生物素标记的mRNA分离,并在体外翻译释放因子2(RF2)进行检测耗尽的大肠杆菌菌株,含有野生型或突变核糖体获得的无细胞提取物。核糖体翻译的生物素标记的mRNA序列停滞在终止密码子区域,由于RF2蛋白质,通常完成翻译终止的情况下。孤立和停滞不前的核糖体含有新合成的肽酰- tRNA从翻译使用SMB的中频反应中删除。这些珠子只能绑定含生物素的消息。
隔离,平移的复合物,可用于分析野生型或突变核糖体元件,或肽- tRNA的序列,以及确定用抗生素或其他分子因素1,14-16核糖体相互作用的结构和功能特性。为了研究这些孤立的核糖体复合体的功能,可以进行肽基转移酶检测在嘌呤霉素的抗生素1存在。要研究翻译复合物的结构变化,以及既定的程序可以使用,如i)交联特定的氨基酸 14和/或ii)烷基化保护分析 1,14,17 。
这本报告中所述的分离过程是高度重现。不幸的是,从相同的翻译序列产生的短肽- tRNA的存在,不能方便地避免这样的肽- tRNA的可能对应到15-20%的总绝缘材料(图2C)。这些污染物的浓度可能会增加,较高浓度的生物素标记基因已被用于或时无细胞提取物的使用旧的或已重复使用多次。因此,它是非常重要的控制组件的质量和浓度在体外翻译反应。另外,高效率的商业重组的无细胞提取物可以用于同样的目的(纯系统)18 。
使用这种方法,生物素- 16 – UMP是随机纳入沿靶mRNA的长度。有一个可能性,可能有一些的ORF含有尿苷大片纳入这个修改过的核苷酸序列,影响他们的翻译的。 biotin-16-UTP/UTP变量的相对浓度测试,以获取最高效的翻译过程中的mRNA的合成。可以用生物素标记的替代方法,针对5' -端,最稳定的mRNA结束。 (一)生物素可以连接到使用3' – NH2ATP(3' -氨基,3' -脱氧腺苷三磷酸腺苷)和T4 RNA连接酶 19的mRNA的5 '端。 (二)5'端生物素标记的寡核苷酸,可连接使用T4 RNA连接酶的基因, 以及 20的5'端。 (三)3' -末端生物素标记的寡核苷酸对应的mRNA的5'端的互补序列,也可以用来隔离翻译复合物。这些生物素标记的寡核苷酸,可以连接到SMB前隔离。后来的SMB连接生物素标记的寡核苷酸,可以允许与他们互补的mRNA序列互动的翻译反应混合物混合。隔离后,混合RNA – DNA区 – 和地区之间的生物素标记的寡核苷酸与mRNA序列杂交 – 核糖核酸酶H可降解,分离从链霉珠陷入僵局的复合物。这种替代方法可能会允许复合物,在未来的结构分析,使用更高分辨率的方法聘用。
The authors have nothing to disclose.
法改会- V的。希望本文献给博士Adriel D.约翰逊,一个美妙的教授,其的首要任务是对学生的教育内存。我们想念你,Adriel。我们感谢杰奎琳莫雷诺,她在协助执行在这项研究中中所描述的实验。支持这项研究是从美国国家科学基金会,MCB – 0615390至CY提供赠款,并到LRC – V提供的启动资金。在亨茨维尔的阿拉巴马大学。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tris base | Sigma | 252859 | ||
Magnesium acetate | Fluka | 63049 | ||
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | ||
Ammonium acetate | Fluka | 09688 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma | P9424 | ||
Leupeptin inhibitor | Sigma | L9783 | ||
Taq-DNA polymerase | Stratagene | 201223 | ||
T7 Maxiprep kit | Promega | P1300 | ||
SMB | Promega | Z5482 | ||
Biotin-16-UTP | Roche | 1388908 | ||
ATP | Sigma | A7699 | ||
GTP | Sigma | G8877 | ||
PEP | Sigma | P7002 | ||
PK | Sigma | P7768 | ||
Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | ||
Folinic acid | Fluka | 47612 | ||
Spermidine | Fluka | 85558 | ||
tRNA from E. coli | Sigma | R1753 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
Tricine | Sigma | T5816 | ||
L-amino acids | Sigma | LAA21 | ||
DTT | Fluka | 43815 | ||
magnetic separation stands | Promega | Z5342 |