Выделение Перевод Рибосомы содержащих пептидил-тРНК на функциональные и структурные анализы

Summary

Главным препятствием для биохимического анализа рибосом содержащих зарождающиеся пептидил-тРНК была присутствии других рибосом в тех же образцах, рибосомы не участвует в переводе определенной последовательности мРНК анализируются. Мы разработали простую методологию, чтобы очистить, исключительно, содержащей рибосомы зарождающейся пептидил-тРНК интересов.

Abstract

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis by antibiotics and during nascent polypeptide synthesis. Some of these antibiotics, and regulatory nascent polypeptides mostly in the form of peptidyl-tRNAs, inhibit either peptide bond formation or translation termination^1-7. These inhibitory events can stop the movement of the ribosome, a phenomenon termed “translational arrest”. Translation arrest induced by either an antibiotic or a nascent polypeptide has been shown to regulate the expression of genes involved in diverse cellular functions such as cell growth, antibiotic resistance, protein translocation and cell metabolism^8-13. Knowledge of how antibiotics and regulatory nascent polypeptides alter ribosome function is essential if we are to understand the complete role of the ribosome in translation, in every organism.

Here, we describe a simple methodology that can be used to purify, exclusively, for analysis, those ribosomes translating a specific mRNA and containing a specific peptidyl-tRNA¹⁴. This procedure is based on selective isolation of translating ribosomes bound to a biotin-labeled mRNA. These translational complexes are separated from other ribosomes in the same mixture, using streptavidin paramagnetic beads (SMB) and a magnetic field (MF). Biotin-labeled mRNAs are synthesized by run-off transcription assays using as templates PCR-generated DNA fragments that contain T7 transcriptional promoters. T7 RNA polymerase incorporates biotin-16-UMP from biotin-UTP; under our conditions approximately ten biotin-16-UMP molecules are incorporated in a 600 nt mRNA with a 25% UMP content. These biotin-labeled mRNAs are then isolated, and used in in vitro translation assays performed with release factor 2 (RF2)-depleted cell-free extracts obtained from Escherichia coli strains containing wild type or mutant ribosomes. Ribosomes translating the biotin-labeled mRNA sequences are stalled at the stop codon region, due to the absence of the RF2 protein, which normally accomplishes translation termination. Stalled ribosomes containing the newly synthesized peptidyl-tRNA are isolated and removed from the translation reactions using SMB and an MF. These beads only bind biotin-containing messages.

The isolated, translational complexes, can be used to analyze the structural and functional features of wild type or mutant ribosomal components, or peptidyl-tRNA sequences, as well as determining ribosome interaction with antibiotics or other molecular factors ^1,14-16. To examine the function of these isolated ribosome complexes, peptidyl-transferase assays can be performed in the presence of the antibiotic puromycin¹. To study structural changes in translational complexes, well established procedures can be used, such as i) crosslinking to specific amino acids¹⁴ and/or ii) alkylation protection assays^1,14,17.

Protocol

1. Сотовые бесплатно Подготовка Extract. Два грамма сухой бактериальной кишечной палочки получены гранулы с середины логарифмической фазы культуры промывают, дважды, с пол-литра буфера, содержащего 10 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 14 мМ ацетат магния, 60 мМ ацетат калия и 50 мкг / мл phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) путем центрифугирования при 5000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. После мытья бактериальных осадок ресуспендируют в 40 мл буфера А. Бактериальных клеток нарушаются использованием французской прессы, применяя 6000 фунтов на квадратный дюйм давления. Это давление соответствует 600 единиц использовании в один дюйм поршня. Нарушается подвески собирается в чистую стеклянную трубку (50 мл). Нарушается подвески обрабатывают 1 мМ dithiotreitol (DTT) и центрифугируют при 30000 мкг в течение 30 мин. Центрифугирования процедура повторяется, используя полученный супернатант. Окончательный супернатант обойтись (1 мл) в микропробирки. Наконец, аликвоты заморожены использованием сухой лед-этанол или жидкий азот и хранятся при температуре -60 ° С или -80 ° C. 2. Подготовка Сотовые бесплатно Выдержки из обедненного RF2. 4,5 мл белка сефарозе бисером 4B шлам смешивают с 5 мл анти-RF2 анти-сыворотки с помощью вращающегося колеса при комнатной температуре, в течение одного часа. Смесь центрифугируют при 2500 мкг отделить бусы из антисыворотки. После отбрасывания супернатант, эти бусы содержащие анти-RF2 антитела (анти-RF2 бусы) которые потом омывают ресуспендирования в 1 мл буфера В, содержащего 35 мМ Трис-ацетат рН 7,8, 10 мМ ацетат магния, 30 мМ ацетата аммония, 60 мМ калий глутамата и 5 мкг / мл ингибитора протеиназ leupeptin. Анти-RF2 бисер затем отделяется от буфера B центрифугированием с использованием тех же условиях, указанных выше. Мытье процедура повторяется дважды. Один мл бесклеточной экстракт смешивают с 150 мкл анти-RF2 бусин с помощью вращающегося колеса, при 4 ° С, в течение двух часов. Смесь центрифугируют при 10 000 мкг для разделения бесклеточной выписка из бисера. Супернатант удаляют и обрабатывают еще раз с другим 150 мкл анти-RF2 бисером. Эта процедура повторяется еще раз с результатом бесклеточного экстракта решение. Окончательный бесклеточного экстракта решение обойтись (100 мкл) в микропробирки. Аликвоты заморожены использованием сухой лед-этанол или жидкий азот и хранятся при температуре -60 ° С или -80 ° C. 3. Подготовка шаблона ДНК. Подготовка 1 мл ПЦР-реакции путем смешивания 600 femtomoles из плазмиды шаблон, содержащий последовательности должны быть переведены (рис. 1), с 0,4 нмоль каждого из олигодезоксинуклеотиды показано на рис 1, 0,2 мкмоль каждого дНТФ и 50 U из Taq- ДНК-полимеразы в буфер поставляемые Stratagene Ко Выполните усиления реакции при последующих условиях: 94 ° С в течение 2 мин, (94 ° C в течение 30 с, 55 ° C в течение 30 с, 72 ° С в течение 1 мин, в течение 30 циклов) и 72 ° С в течение 12 мин. Purify ПЦР-продуктов путем осаждения ДНК, добавив 1 / 10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,2, и 2-х томах ледяной этанола. Повторите процедуру осадков еще раз. Ресуспендируют ДНК в 100 мкл диэтил-pyrocarbonate (DEPC) лечение водой. Как правило, эта процедура дает 100 мкг 600 б.п. продукт ДНК. Проверьте целостность продуктов ПЦР методом электрофореза на гелях агарозы. 4. Подготовка Биотин Маркированный мРНК. Подготовка 100 мкл в пробирке транскрипции реакцию в DEPC очищенной воды путем смешивания 5 мкг ПЦР-порожденных фрагмент ДНК с 0,5 мкмоль АТФ, CTP, GTP, 0,3 мкмоль из UTP, 50 нмоль биотина-16-UTP, и 10 мкл Т7 ферментом смеси в буфер поставляемые Promega Ко Инкубируйте реакционной смеси при температуре 37 ° С в течение 3 часов. Чтобы определить количество мРНК получены, ДНК-матрицы должны быть устранены путем добавления РНКазы без ДНКазы. Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 10 мин. Purify мРНК продукции путем осаждения РНК, добавив 1 / 10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,2, и 2-х томах холодного этанола. Повторите процедуру осадков еще раз. Ресуспендируют мРНК в 100 мкл DEPC лечение водой. Как правило, эта процедура дает около 1-2 мг 600 нт биотин меченых мРНК продукта. Проверьте целостность биотин маркированной продукции мРНК методом электрофореза на агарозном гелях. 5. Выделение Перевод Рибосомы содержащих пептидил-тРНК. Подготовка 500 мкл в пробирке перевод реакционной смеси в DEPC очищенной воды путем смешивания 10-15 мкг биотин-меченых мРНК с 75 нмоль каждого из девятнадцать аминокислот, все, кроме аминокислота, которая будет заменена на радиоактивной аминокислоты , 50 мкКи радиоактивного аминокислота (37MBq) и 20-5 0 мкл RF2 обедненный бесклеточной экстракт, в буфере реакционной смеси, содержащей 40 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 10 мМ ацетат магния, 175 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата аммония, 2 мМ ДТТ, 2 мМ АТФ, 0,5 мМ ГТФ, 30 мМ фосфоенолпирувата (PEP), 0,3 Ед / мл пируваткиназы (PK), 3,5% полиэтиленгликоля 8000, 1 мМ спермидин, 20 мкг / мл фолиевой кислоты и 250 мкг / мл тРНК из Е. палочки. Инкубируйте реакционной смеси при температуре 37 ° С в течение 10 минут. Порядок добавления компонентов реакции является очень важным. Бесклеточной выписка должна быть смешана с первым буфером раствора, содержащего аминокислоты и конечная смесь выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы активация рибосом. Позже, меченных биотином мРНК добавлены. Для структурного анализа с использованием процедуры химической модификации, добавление радиоактивных аминокислот не требуется. Добавить в смесь перевод реакции – 3 мл стрептавидином парамагнитных шариков (SMB), взвешенных в буфере С, содержащего 35 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 10 мМ ацетат магния, 175 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата аммония и 1 мМ DTT. Инкубируйте новая подвеска при комнатной температуре в течение 10 мин. Отдельные малого и среднего бизнеса из смеси с применением магнитного поля (МП) с использованием магнитных стоит разделения. Ресуспендируют малого и среднего бизнеса в буфере С и отдельных бусин еще раз, используя MF. Повторите эту процедуру промывки в два раза. Ресуспендируют бисером в 500 мкл буфера C, хранят подвеску на льду, а также выполнять следующую процедуру немедленно. 6. Анализ Изолированные Рибосомы содержащих пептидил-тРНК. Для пептидил-тРНК Смешать 10 мкл SMB (приостановлено в буфере С) с 10 мкл загрузки буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 2,5% (объем / объем) глицерин, 4% додецилсульфата натрия, 2 мМ DTT и 0,2 мг / мл бромфенола синий. Решение компонентов, прикрепленных к бисером, запустив образцов в 10% Трис-tricine гели полиакриламида. Сухой гели с помощью вакуумного геля для сушки волос. Проверьте целостность и очистки пептидил-тРНК, подвергая сухой гель для рентгеновской пленки. Для рибосомальной РНК Добавить 190 мкл 2 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) раствор, приготовленный с DEPC-очищенной воды и 200 мкл фенола уравновешенной с водой, до 10 мкл бусины подвески. Смешайте подвески энергичным вортексе и отдельные неорганические фазы из органической фазы центрифугированием при 10 000 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре. Соберите верхний слой воды в новых микропробирок. Осадок РНК из слоя воды, добавив 1 / 10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,2, 1 мкл 20 мг / мл гликогена решение, и 2-х томах ледяной этанола. Ресуспендируют РНК в 10 мкл DEPC обработанной воды. Проверьте целостность рибосомных РНК с помощью электрофореза на гелях агарозы. Как правило, 50 мкл суспензии бусин дает 1 мкг рибосомных РНК. 7. Представитель Результаты: На рисунке 2 представлены результаты серии анализов оценки качества и функциональности перевода рибосом, выделенных помощью процедуры, описанной. Наблюдение уникальную группу решен в полиакриламидном геле указывает на присутствие полипептидов связаны с биотин-меченых мРНК прилагается к SMB (рис. 2А). Очистка рибосомной РНК с помощью этой процедуры устанавливается наличие рибосом связана с этими меченных биотином мРНК, а также (рис. 2В). Добавление пуромицина, антибиотик, который вызывает пептидил-трансферазы рибосомы, приводит к расщеплению зарождающейся пептидил-тРНК 1. Это наблюдается как сдвиг в структуре миграции изолирован полипептид в полиакриламидном геле (рис. 2С). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что биотин-меченых мРНК прилагается к SMB содержат функциональные рибосом с пептидил-тРНК. Изоляция переводе рибосомы, содержащие конкретные пептидил-тРНК позволяет изучать эффекты пептидил-тРНК, антибиотики и другие молекулы, на рибосомы функции (рис. 3А), а на рибосомы структуру (рис. 3В). В примерах, представленных здесь антибиотик sparsomycin и аминокислота триптофан (Trp) тормозят гидролитического расщепления зарождающейся tnaC-тРНК пептидил-тРНК-индуцированных RF2 в изолированные рибосомы (рис. 3А). Взаимодействие sparsomycin или Trp с рибосомой также вызывает структурные изменения в некоторых нуклеотидов, которые составляют 23S рРНК рибосомы (рис. 3В). Таким образом, биологический материал, полученный с помощью процедуры, описанные здесь, полезны в получении дополнительных понимание структурных контакты участие в подавлении функции рибосомы при его взаимодействии с различными молекулярными факторами. ove_content "> Рисунок 1. Процедура используется для производства и очистки переводе рибосомы содержащие пептидил-тРНК. Фрагменты ДНК ок. 650 б.п. в длину, содержащих ген tnaC и прилегающие к нему области, как показано на рисунке, используются в качестве шаблонов при подготовке мРНК содержащие биотин, [(био) UMP] мРНК. Эти фрагменты ДНК производятся процедуры ПЦР с использованием олигодезоксинуклеотиды указано в верхней части рисунка. Подчеркнутые буквы знак расположения промотора T7 закодирована в нуклеотидной грунт. Жирным шрифтом указывают Обуви-Дальгарно последовательность, которая используется в переводе tnaC последовательностей мРНК. Промоутер T7 в фрагмент ДНК признан Т7 РНК-полимеразы, которая используется для транскрипции (стрелка) tnaC последовательности и некодирующих последовательностей вниз по течению. Транскрипция теряет силу, когда РНК-полимераза достигает 3'-конца фрагмента ДНК, после rpoBC последовательности терминатора (rpoBC «т»). Стволовых петля структуры rpoBC терминатор защищает мРНК с 3'-5 'exoribonuclease активность присутствует в бесклеточных экстрактов, используемых в реакции в пробирке перевода. Изолированные [(био) UMP] мРНК, используются для создания в тупик, переводя рибосомы, используя в анализах пробирке перевода. TnaC последовательность в [(био) UMP] мРНК переводится рибосомой которые киосков, когда последняя аминокислота содержится, в связи с отсутствием выпуска фактор (RF2) из реакционной смеси. Рибосом [(био) UMP] комплексы мРНК изолированы от общей смеси реакции с помощью стрептавидином магнитных шариков (SMB), который связывает биотин-меченых нуклеотидов включены в мРНК. Малого и среднего бизнеса связана с рибосомой-[(био) UMP] мРНК комплексов выделяются из общей реакционной смеси с помощью магнитного поля (МП). Рисунок 2. Структурно-функциональный анализ изолированных комплексов. А) В реакциях пробирке перевод проводились с [(био) UMP] мРНК, в которых стартовый кодон гена tnaC был заменен стоп-кодон. Конечных продуктов были выделены использованием стрептавидина бусы, как это показано на рис 1. Продукты реакции и изолированных молекул затем анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. TnaC-тРНК и tnaC пептид полосы обозначены. Б) Общая РНК была выделена из зашедших в тупик комплексов с использованием фенола процедуры экстракции. Каждый изолированной РНК была решена с помощью электрофореза в агарозном гелях. Рибосомных РНК (рРНК) указаны. С) Изолированные комплексы, содержащие tnaC-тРНК инкубировали с (+) или без (-) 0,02 мМ пуромицин (Puro) при комнатной температуре в течение 10 мин. Пептид tnaC были названы во время трансляции с помощью [35С]-метионина () или [3 H]-пролина (Б). Рисунок 3. Структурно-функциональный анализ рибосом содержащие tnaC-тРНК, которые привязаны к антибиотикам sparsomycin, или аминокислоты триптофана. ) Изолированные комплексы, содержащие tnaC-тРНК инкубировали с (+) или без (-) sparsomycin (Spar) и триптофана (Trp) при комнатной температуре в течение 5 мин. Позже, смеси были смешаны с RF2 и инкубировали при 37 ° С в течение 20 мин. Б) Анализ метилирования изменения в 23S рРНК индуцированных молекул обязательны рибосомы. Изолированные комплексы предварительно инкубировали с (+) или без (-) 2 мМ Trp или Spar в течение 5 мин при 37 ° C. Затем, алкилирования агента, диметилсульфата, был добавлен и смеси инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 мин. Общую РНК экстрагировали и анализы удлинения праймера проводились с [32Р]-меченных oligodeoxynucleotide дополняют нуклеотидов 23S рРНК которые расположены на расстоянии 100 нуклеотидов ниже по течению от модифицированного нуклеотида. Конечными продуктами расширение анализы были решены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. 23S рРНК нуклеотидов, пострадавших от наличия или Trp Spar указаны.

Discussion

Эта изоляция процедуре, описанной в настоящем отчете, высокой воспроизводимостью. К сожалению, наличие коротких пептидил-тРНК производится из той же последовательности перевода не может быть удобно избегать таких пептидил-тРНК может соответствовать 15-20% от общего объема материала изолированы (рис. 2С). Эти загрязнители могут увеличение концентрации при более высоких концентрациях меченных биотином мРНК были использованы или когда бесклеточных экстрактов используются старые или были повторно использованы несколько раз. Поэтому, очень важно для контроля качества и концентрации компонентов в реакциях пробирке перевода. Кроме того, коммерческие высокой эффективности восстановленного бесклеточных экстрактов доступны, которые могут использоваться для тех же целей (PURE системы) ^18.

Используя этот метод, биотин-16-UMP случайно включили по длине целевой мРНК. Существует возможность того, что некоторые ORF, содержащей уридин путей, возможно, включили это модифицированного нуклеотида в их последовательности, влияющие на их перевод. Переменная относительные концентрации biotin-16-UTP/UTP должны быть проверены в процессе синтеза мРНК с целью получения наиболее эффективного перевода. Альтернативные методы маркировки биотина может быть использован, ориентированных на 5'-конце, наиболее стабильным концу мРНК. (Я), биотина может быть присоединен к 5'-концу мРНК с использованием 3'-NH2ATP (3'-амино-, 3'-дезоксиаденозина трифосфат) и Т4 РНК-лигазы ^19. (II) 5'-конце биотин-меченых олигонуклеотидных может быть присоединен к 5'-концу мРНК с использованием РНК-лигазы Т4, а ^20. (III) 3'-конце меченных биотином олигодезоксинуклеотиды которые соответствуют комплементарную последовательность на 5'-конце мРНК, также может быть использован для выделения переводе комплексов. Эти биотин помечены олигодезоксинуклеотиды может быть присоединен к SMB до изоляции. Позже малого и среднего бизнеса придается меченных биотином олигодезоксинуклеотиды может быть смешан с переводом смеси реакции, чтобы их взаимодействие с комплементарными последовательностями мРНК. После изоляции, гибридных РНК-ДНК регионе – и в регионе гибридизации между меченных биотином oligodeoxynucleotide и мРНК последовательности – может быть снижено использованием РНКазы H, отделяя застопорился комплексов из стрептавидином шарики. Этот альтернативный метод может позволить комплексов на работу в будущем структурный анализ с использованием выше методы разрешения.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Tris base		Sigma	252859
Magnesium acetate		Fluka	63049
Potassium glutamate		Sigma	G1501
Ammonium acetate		Fluka	09688
PMSF		Sigma	P7626
Protein A sepharose 4B slurry beads		Sigma	P9424
Leupeptin inhibitor		Sigma	L9783
Taq-DNA polymerase		Stratagene	201223
T7 Maxiprep kit		Promega	P1300
SMB		Promega	Z5482
Biotin-16-UTP		Roche	1388908
ATP		Sigma	A7699
GTP		Sigma	G8877
PEP		Sigma	P7002
PK		Sigma	P7768
Polyethylenglycol 8000		Fluka	81268
Folinic acid		Fluka	47612
Spermidine		Fluka	85558
tRNA from E. coli		Sigma	R1753
DEPC		Sigma	D5758
Tricine		Sigma	T5816
L-amino acids		Sigma	LAA21
DTT		Fluka	43815
magnetic separation stands		Promega	Z5342