צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים
Summary
התפתחות מוקדמת של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מאופיינת במספר שינויים בצורת התא כי הם גם מתאים גישות הדמיה. מאמר זה יתאר כלים בסיסיים ושיטות הדרושים הדמיה confocal חיים של עוברים תסיסנית, יתמקד בשינוי צורת התא הנקרא cellularization.
Abstract
העובר המתפתח תסיסנית melanogaster עובר מספר שינויים בצורת התא כי הם נוחים מאוד לחיות הדמיה confocal. צורת התא שינויים לטוס מקבילים לאלה של יצורים עילאיים, והם כונן המורפוגנזה רקמות. לכן, במקרים רבים, המחקר שלהם יש השלכות ישירות להבנת מחלות אנושיות (טבלה 1) 1-5. בסולם המשנה הסלולר, אלה שינויים בצורת התא הם תוצר של פעילויות, החל ביטוי גנים על התמרה האות, קוטביות התא, שיפוץ cytoskeletal וסחר הממברנה. לכן, את העובר תסיסנית מספק לא רק את ההקשר כדי להעריך שינויים בצורת התא ככל שהם מתייחסים המורפוגנזה רקמות, אלא גם מציע סביבת פיזיולוגיים לחלוטין ללמוד את המשנה הסלולר פעילות תאים לעצב.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד תמונה תאים מסוים לשנות צורה נקרא cellularization. Cellularization הוא תהליך של צמיחה פלזמה דרמטי קרום, וזה בסופו של דבר ממיר את העובר סינסיציאלי לתוך blastoderm הסלולר. כלומר, בכל שלבי הביניים של מחזור mitotic 14, הממברנה הפלסמטית בו זמנית invaginates סביב זה של גרעינים 6000 ~ מעוגן cortically ליצור גיליון של תאים אפיתל העיקרי. בניגוד להצעות קודמות, cellularization אינו מונע על ידי contractility שרירן-2 6, אבל היא מונעת בעיקר על ידי במקום exocytosis של קרום מחנויות פנימי 7. לפיכך, cellularization היא מערכת מצוינת ללימוד סחר קרום במהלך שינויים בצורת התא הדורשים הממברנה הפלסמטית invagination או הרחבה, כגון cytokinesis או רוחבי, אבובית (T-אבובית) המורפוגנזה בשריר.
שים לב שזה פרוטוקול מוחל בקלות הדמיה של אחרים שינויים בצורת התא בעובר לעוף, רק דורש הסתגלות קלה כגון שינוי בשלב של איסוף העובר, או באמצעות "דבק העובר" על מנת לטעון את העובר בכיוון טבלה ספציפיים ( 1) 8-19. בכל מקרה, זרימת העבודה הוא בעצם אותו דבר (איור 1). שיטות תקן שיבוט תסיסנית transgenesis משמשים להכנת מניות לעוף יציב המבטאים חלבון של עניין, התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או על גירסאותיה, וזבובים אלה מהווים מקור מתחדש של עוברים. לחלופין, חלבוני ניאון / בדיקות מוצגים ישירות באמצעות הזרקת מיקרו פשוט טכניקות 9-10 לעוברי לעוף. ואז, תלוי במקרה התפתחותיים שינוי צורת התא להיות צילמו, עוברים נאספים מבוים על ידי המורפולוגיה על מיקרוסקופ לנתח, ואת מיקומו ולבסוף ועלה הדמיה זמן לשגות על מיקרוסקופ confocal.
Protocol
Discussion
פרוטוקול המתואר במסמך זה יאפשר הדמיה לחיות, confocal של מספר שינויים בצורת התא בעובר המתפתח לעוף. מניות ה-GFP הדמיה יכול להיות מוכן על ידי מעבדה הפרט (טבלה 2), אך מניות רבות כאלה זמינים גם בפומבי ממרכזי כגון Bloomington תסיסנית במלאי מרכז באוניברסיטת אינדיאנה ( <a href="http://flystocks….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
בהכרת תודה אנו מודים אריק Wieschaus, שסיפק את הבסיס שעליו בפרוטוקול זה פותחה. העבודה שלנו היא נתמכת על ידי ורנה & Marrs מקלין המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית פרס Start-up, ביילור לרפואה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Slides | Fisherbrand/Fisher Scientific | 12-550-343 | ||
| Cover slips 25×25 | Fisher Scientific (Corning #2865-25) | 1 2-524C | ||
| Squirt bottles (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | ||
| 50 ml Falcon tubes | Fisher Scientific (BD# 352070) | 14-432-22 | ||
| Bulbs for small pipets, 1 mL | Fisherbrand/Fisher Scientific | 03-448-21 | ||
| Scintillation vials with caps | VWR (Wheaton #986546) | 66021-533 | ||
| Tri-Corn Beakers, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | ||
| BD Falcon Petri dish 60x15mm | Fisher Scientific (BD# 351007) | 08757 100B | ||
| BD Falcon Cell strainer | Fisher Scientific (BD#352350) | 08-771-2 | ||
| Yellow pipet tips | Ranin | L200 | ||
| Stainless steel mesh, 304, 12×24 | Small Parts | CX-0150-F-01 | ||
| Glass 5¾ inch Pasteur Pipets | Fisherbrand/Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| P4 Filter paper | Fisherbrand/Fisher Scientific | 09-803-6F | ||
| Rubber bands | Office Max | A620645 | ||
| Scotch double-sided tape, ½ inch | Office Max | A8137DM-2 | ||
| Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | ||
| Dumont #5 Forceps High Precision Inox | Electron Microscopy Services | 72701-DZ | ||
| Razor blades | VWR (BD #214010) | 55411-050 | ||
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | ||
| Heptane | Fisher Chemical/Fisher Scientific | H360-1 | ||
| BD Bacto Agar | VWR (BD# 214010) | 90000-760 | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | ||
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | ||
| Red Star Active Dry Yeast | LeSaffre | 15700 | ||
| Paper towels, C-fold | Kleenex | |||
| Heavy duty aluminum foil | Reynolds Wrap | |||
| Bleach | Austin’s A-1 Commercial | |||
| 100% Apple juice | Ocean Spray or Tree Top |
References
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. Toward understanding the genetic basis of neural tube defects. Clin Genet. 71, 295-310 (2007).
- Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein. Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131, 3021-3034 (2004).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).
- Lecuit, T., Wieschaus, E. Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo. J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo. Dev Cell. 16, 93-104 (2009).
- Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation. Curr Biol. , (2010).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. u. f. a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization. Dev Cell. 14, 775-786 (2008).
- Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134, 567-578 (2007).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457, 495-499 (2009).
- Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation. Nature. 429, 667-671 (2004).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Dev Cell. 11, 459-470 (2006).
- Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation. Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr Biol. 20, 359-366 (2010).
- Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. a. r. t. i. n. e. z., A, . Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila. Development. 136, 1889-1898 (2009).
- Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure. Cell. 137, 1331-1342 (2009).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization. J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
