在细胞线粒体功能分析的方法的描述。线粒体产生的个人资料提供线粒体的功能,可以在一次实验中测量的四个参数:基础呼吸速率,ATP挂钩呼吸,质子漏,和储备能力。
的能力,测量细胞的新陈代谢和理解线粒体功能障碍,使全世界的科学家了解肥胖的线粒体功能的作用,糖尿病,衰老,癌症,心血管功能和安全性的毒性,以推动他们的研究。
细胞代谢底物的吸收,如氧,葡萄糖,脂肪酸,谷氨酰胺,并随后通过一系列酶控制的氧化和还原反应的能量转换过程中。在生产ATP,释放的热量和化学副产品,如乳酸和CO 2到细胞外环境,这些细胞内的生化反应结果。
进入细胞的生理状态,并改变这些细胞的状态可以得到宝贵的见解,通过测量细胞消耗氧气,线粒体呼吸的指标利率 – 耗氧率 – 或OCR。细胞也通过糖酵解生成ATP,即:葡萄糖转化为乳酸,独立的氧气。在培养的井,乳酸是质子的主要来源。测量乳酸产生通过间接释放到细胞外的周边中等质子,从而导致介质酸化提供了细胞外酸化率 – 或ECAR。
在这个实验中,C2C12成肌细胞在海马细胞培养板的密度接种。建立基准利率基础耗氧量(OCR)和细胞外酸化(ECAR)率测量。细胞代谢扰动由三个增加不同的化合物(继承),这种转变细胞的生物能个人资料。
这个实验是来自一个经典的实验,以评估线粒体作为一个框架,建立在更为复杂的实验,旨在了解双方的生理和病理生理线粒体功能和预测细胞的能力,以应对压力和/或侮辱。
这个实验是来自经典的实验探测线粒体功能和作为一个建立更为复杂的实验,旨在了解,在细胞的新陈代谢,线粒体功能和整体生物能的各种变化的框架。
应在本实验中使用的所有化合物的浓度提供了极大的作用的优化。也就是说,必须执行单独的滴定实验,以确定这些值。这是与FCCP尤其重要,作为滴定曲线往往是相当尖锐的,太多FCCP实际上可以减少在OCR的回应。典型的范围(终浓度),以测试将是:
请注意,每个上述化合物(尤其是FCCP)的反应将被检测媒体组成(基本类型,葡萄糖,丙酮酸,存在/ BSA的情况下,等)的影响。此外,如果XF检测媒体组成的改变,优化将需要重新执行。丙酮酸的存在和浓度是特别重要的,在取得最大呼吸能力由于FCCP。海马生物科学的观察,在一些细胞系,遗漏丙酮酸废除的细胞的能力,以最大限度地回应(基线以上)FCCP。通常情况下,浓度为1-10毫米丙酮酸,应进行测试,以了解最佳浓度的丙酮酸,以获得最大的呼吸。请注意,[丙酮酸]和[糖],可能需要“跨滴定”,以获得最佳的媒体实验条件。
OCR随时间变化和另一个显示ECAR随时间的图形显示,本次实验的典型结果介绍如下:
图2。OCR的随时间变化
图3。ECAR随时间变化
在这里,我们观察到OCR和ECAR预期反应的细胞与每个连续的复合处理。对于寡,OCR作为ATP合成阻断线粒体复合物V.由于细胞不能合成ATP通过OXPHOS,他们恢复糖酵解,以满足他们对ATP的需求下降,因此,我们观察ECAR增加。如前所示,FCCP行为作为偶联剂。由于细胞必须克服跨线粒体膜的质子漏,OCR显着增加,更多的氧气被消耗掉多余的质子穿过线粒体膜泵。最后,鱼藤酮抑制线粒体复合物I和综合第三,分别,这会导致停止在电子传递链的电子流,从而氧气消耗量大幅降低。
图4呼吸参数。
除了呼吸和ECAR的预期变化,呼吸参数,可从这个数据。这是总结在上图中:
这里我们可以看到,我们可能会获得有关的基底细胞呼吸,致力于ATP的生产以及致力于维持质子梯度(H +泄漏)的金额的氧气消耗量的百分之的信息。此外,我们可能会耦合的呼吸(有时也被称为呼吸能力作为备用)的条件下获得最大的呼吸频率,最后,我们可以判断氧气消费量不因线粒体进程。
一个研究数量迅速增加是采用这种线粒体的个人资料,评估细胞的生物能,确定线粒体功能障碍和预测细胞的能力,以应对压力和/或侮辱。欲了解更多的信息和对本实验方法和备用呼吸能力的想法的细节, 请参阅参考1-8以下出版物。
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | ||
DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | ||
DMSO | Sigma | D8418 | ||
Distilled Water | Gibco | 15230-170 | ||
Calibration buffer | Seahorse Bioscience |