Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Summary

In diesem Video zeigen wir, Visualisierung von PKC-Translokation in lebenden Zellen mit fluoreszenzmarkierten PKCs.

Abstract

Protein-Kinase-Cs (PKCS) sind Serin-Threonin-Kinasen, die eine zentrale Rolle spielen bei der Regulation einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Zellwachstum und Lernen und Gedächtnis. Es gibt vier bekannte Familien von PKC-Isoformen bei Wirbeltieren: klassische PKCs (α, ßi, βII und γ), Roman Typ I PKCs (ε und η), neuartige II PKCs (δ und θ) und atypische PKC (ζ und ι ). Die klassische PKCs werden durch Ca ^{2 +} aktiviert und diacylclycerol (DAG), während der Roman PKCs durch DAG aktiviert werden, sondern sind Ca ^{2 +-unabhängig.} Die atypische PKC sind weder durch Ca ^{2 +} noch DAG aktiviert. In Aplysia californica, unser Modellsystem zur Gedächtnisbildung Studie, gibt es drei Nervensystem spezifischen PKC-Isoformen einer aus jeder großen Klasse, nämlich der konventionellen PKC Apl I, die neue Typ-I-PKC Apl II und der atypischen PKC Apl III. PKCS Lipid-Kinasen aktiviert und damit die Aktivierung der klassischen und neuen PKC als Reaktion auf extrazelluläre Signale wurde häufig mit PKC-Translokation aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran korreliert. Daher hat die Visualisierung PKC-Translokation in Echtzeit in lebenden Zellen werden ein unschätzbares Werkzeug für die Aufklärung der Signalwege, die PKC-Aktivierung führen. Zum Beispiel hat diese Technik für uns erlaubt festzustellen, dass verschiedene Isoformen der PKC unter verschiedenen Bedingungen translozieren, um verschiedene Arten von synaptischer Plastizität vermitteln und dass Serotonin (5HT) Aktivierung von PKC Apl II erfordert die Herstellung der beiden DAG und Phosphatidsäure (PA) für Translokation ^1-2. Wichtig ist, dass die Fähigkeit, die gleichen Neuron visualisieren wiederholt hat uns erlaubt, zum Beispiel zu einer Desensibilisierung der PKC Reaktion in exquisite detail ³ zu messen. In diesem Video haben wir jeden Schritt der Herstellung Sf9-Zellkulturen zu demonstrieren, haben Kulturen der Aplysia sensorischen Neuronen in einem anderen Video Artikel ⁴ beschrieben worden sind, zum Ausdruck fluoreszenzmarkierten PKCs in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen und Live-Darstellung von PKC-Translokation in Reaktion auf verschiedene Aktivatoren mittels Laser-Scanning-Mikroskopie.

Protocol

1. Erstellung und Pflege von Sf9-Monolayer Kulturen

1. Sf9-Zellkultur und Wartung in einer Gewebekultur Abzug durchgeführt.
2. Sf9-Zellen werden aus Spodoptera frugiperda Eierstock-Zellen (Sf21 Zellen) abgeleitet und kann als eingefrorene Zellen in Grace Medien von Invitrogen erworben werden.
3. Platz 8 ml Insektenmedium Grace, ergänzt (1X), zu dem 30% fötales Rinderserum (FBS) hat in einer 75 cm ² Zellkulturflasche mit einer verkantet Hals aufgenommen worden.
4. Auftauen gefrorenen Rohr Sf9 Zellen schnell im 37 ° C Wasserbad, indem Sie den Schlauch hin und her (ca. 1-2 Minuten).
5. Transfer Sf9-Zellen, die 75 cm ² Zellkulturflasche und Rock Platte vorsichtig von Hand, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
6. Inkubieren 1-2 Stunden bei 27 ° C, bis die Zellen angeschlossen sind.
7. Entfernen Sie altes Medium und ersetzen mit 10 ml Insektenmedium freshGrace ist mit 30% FBS.
8. Inkubation bei 27 ° C, bis die Zellen konfluent sind.
9. Zur Aufrechterhaltung Monolayerkulturen, entfernen Sie alte Medium aus dem konfluenten Flasche Sf9-Zellen und 5 ml Medium Insekten Grace mit 10% FBS.
10. Leicht auf der Seite der Flasche Leitungswasser mehrmals Sf9-Zellen zu lösen.
11. Mit einem 10 mL Pipette und eine Pipette, die Medien Pipette nach oben und unten einmal sanft, Spritzen Kolbenwand beim Pipettieren unten. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles 15 mL Polysterene Röhre.
12. Geben Sie 2 ml Sf9 Zellsuspension bis 8 ml Insektenmedium Grace mit 10% FBS (1:5 Verdünnung auf log-Phase Wachstum aufrecht zu erhalten) in neue 75 cm ² Zellkulturflasche und Rock Platte vorsichtig mit der Hand.
13. Inkubation bei 27 ° C, bis die Zellen konfluent sind.

2. Expression von fluoreszenzmarkierten PKCs in Sf9 Zellen

1. Für Live-Imaging-Experiment, Kultur Sf9-Zellen auf 35 mm MatTek Glasboden Kultur disheswith eine Glasfläche von 14 mm und einem Deckglas Dicke von 0,16 bis 0,19 mm.
2. PKCs mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind in Sf9-Zellen mit Cellfectin II Transfektionsreagenz folgende Empfehlung des Herstellers mit den Änderungen detaillierte unten angegeben.
3. Tag 1: Vor dem Ausplattieren der Zellen, behandeln jeden MatTek Gericht mit Insekten Medium Grace mit 10% FBS für mindestens 30 Minuten.
4. Graf Sf9-Zellen aus Schritt 11 (oben) unter Verwendung eines Hämozytometers.
5. Platte 0,05 x 10 ⁶ Zellen pro MatTek Deckglas in einem Gesamtvolumen von 150 ul. Lassen Sie die Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur befestigen.
6. Geben Sie 2 ml Grace mit 10% FBS zu jedem Gericht 1 mL der zu einer Zeit, langsam zu vermeiden Ablösen der Zellen ergänzt.
7. Inkubation bei 27 ° C über Nacht.
8. Von diesem Punkt an, verwenden Sie der Empfehlung des Herstellers für die Transfektion von Sf9-Zellen mit Plasmid-DNA.
9. Tag 2: Transfektion von Sf9-Zellen mit fluoreszenzmarkierten PKCs mit Cellfectin II Transfektionsreagenz. Wir haben oft in diesem System PKCs mit verbesserter Green Fluorescent Protein (eGFP) und monomeren Red Fluorescent Protein (mRFP) (Details für Plasmid-Konstruktion wurden bisher ^2,5) beschrieben getaggt co-exprimiert. Expression eines fluoreszierenden Proteins in einem Zeit-Ausbeuten zwischen 70-80% exprimierende Zellen 72 Stunden nach der Transfektion. Co-Expression von zwei fluoreszierenden Proteinen verringert Transfektionseffizienz zu etwa 30% co-exprimierenden Zellen. Als Co-exprimierenden eGFP-markierten PKC und mRFP-markierten PKC, verwenden Sie 2x mehr Plasmid-DNA für die mRFP-markierte Protein für eine optimale Protein-Expression.
10. Führen Sie Live-imaging 48-72 Stunden nach der Transfektion (für eine optimale Protein-Expression, warten Sie 72 Stunden).

3. Expression von fluoreszenzmarkierten PKCs in Aplysia sensorischen Neuronen

1. Vorbereitung der Aplysia neuronalen Zellkulturen hat in einer Video-Artikel wurde von Zhao und seine Kollegen ⁴ beschrieben.
2. PKCs mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind in Aplysia sensorischen Neuronen mit Mikroinjektion Verfahren detaillierte unten angegeben.
3. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1% Fast Green (FCF) in destilliertem Wasser, Filter mit einer Spritze und einer 28 mm Spritzenfilter (0,20 um). Aliquotieren und bei -20 ° C.
4. Mikroinjektion der sensorischen Neuronen können am Tag 1 oder Tag 2 nach der Isolierung der Nervenzellen durchgeführt werden, aber wir finden, die darauf warten 2 Tage ermöglicht eine bessere Zelle Einhaltung der Deckglas.
5. Am Tag 2 nach der Isolierung der sensorischen Neuronen, Tauwetter ein Aliquot Fast Green und Filter wieder mit einer Spritze und einer 28 mm Spritzenfilter (0,20 um).
6. Bereiten Sie eine Lösung von Plasmid-DNA in destilliertem Wasser mit 0,5% Fast Green. Die Konzentrationen von Plasmid-DNA so hoch wie 0,4 ug / ul kann verwendet werden, aber es wird nicht empfohlen, über diesen Werten gehen.
7. Filtern Sie die Plasmid-DNA / Fast Green-Lösung mit einer 1 ml Spritze und einem 4-mm-Spritzenvorsatzfilter (0,20 um).
8. Centrifuge die Plasmid-DNA / Fast Green Lösung bei 16110 xg für 15 Minuten mit einem Mikrofonrocentrifuge.
9. Bereiten scharfen Elektroden für die Mikroinjektion von Neuronen mit einer Mikroelektrode Puller (Sutter Flaming / Brown Micropipette Puller, Modell P-97). Verwenden einer Box Faden ziehen Glasmikroelektroden mit 1 mm Außendurchmesser, 0,75 mm Innendurchmesser und 100 mm Länge mit dünnwandigen Glaskapillaren mit einem Faden im Inneren (World Precision Instruments TW100F-4). Für weitere Informationen über Ziehen Mikroinjektion Elektroden entnehmen Sie bitte Sutter Elektrode Kochbuch.
10. Füllen Sie jede Elektrode mit 2 ul von Plasmid-DNA / Fast Green-Lösung mit Microloader Pipettenspitze (Eppendorf CA32950-050).
11. Übertragen Sie die MatTek Glasboden Kulturschale mit Aplysia neuronalen Kulturen, die Mikroinjektion Station.
12. Die Mikroinjektion Station besteht aus folgenden Komponenten: eine hausgemachte großen Glas Bühne, um die Kulturschalen auf einer Schwingungsisolierung Tabelle (Kinetic Systems Schwingungsisolierung Workstation), ein Stereo-scope mit externen Halogen-Beleuchtung, einem Mikromanipulator (Sutter Huxley Wandtyp Micromanipulator halten welches sowohl Grob-und ultra-feine Positionierung in den drei-Achse), einer Mikroelektrode Halter verbunden, um eine pneumatische Pumpe (World Precision Instruments PV820 Pneumatische Pico-Pump). Der Druck Eingang der pneumatischen Pumpe ist eine komprimierte Stickstoff Tank verbunden.
13. Legen Sie eine Mikroelektrode in die Mikroelektroden-Halter.
14. Profil unter einem Stereomikroskop, legen Sie die Spitze der Mikropipette in den Zellkern.
15. Deliver kurze Druckimpulse von Stickstoff (10 bis 100 ms Dauer, 20 lb / in ^2), bis der Kern wird gleichmäßig durchdringt und grün.
16. Inkubieren Sie die Zellen für 4 Stunden bei Raumtemperatur und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. Für eine optimale PKC-Translokation, live-imaging Experiment 20 bis 24 Stunden nach der Injektion.

4. Visualisierung von PKC-Translokation in Living Cells Sf9 und in Aplysia sensorischen Neuronen

1. Für die Bildgebung, verwenden wir ein Zeiss LSM510 invertierten konfokalen Mikroskop mit einem Axiovert 200.
2. Imaging-Protokoll ist das gleiche für Sf9-Zellen und für die Aplysia sensorischen Neuronen mit Ausnahme der folgenden: Sf9 Zellen werden mit einem x63 Ölimmersionsobjektiv abgebildet, während Aplysia sensorischen Neuronen mit einem x40 Ölimmersionsobjektiv abgebildet werden. Sf9-Zellen werden in einem temperierten Raum bei 26-27 ^o C gehalten abgebildet, während Aplysia sensorischen Neuronen bei Raumtemperatur etwa 18-20 ^o C gehalten werden abgebildet
3. Wir verwenden einen 30 mW Argon-Laser (Anregung bei 488 nm) mit 50% Laserleistung zum Bild PKC mit eGFP-Protein und ein HeNe-Laser (Anregung bei 543nm), um Bild PKC mit mRFP Protein markiert markiert. Die Argon-und HeNe-Laser-Linien abgeschwächt bis 4% und 50% Sendeleistung bzw. vor der Aufnahme und der Lochkamera ist eine angepasst.
4. Es ist wichtig, die Kulturschale auf dem Imaging-Bühne stabilisiert zu haben und Bewegung oder Vibration zu vermeiden.
5. Nehmen Sie 1 ml Kulturmedium aus der Schale vorsichtig mit einer 10 ml Pipette Verlassen 1 mL Gesamtvolumen in die Schüssel.
6. Nehmen Sie Bilder im mittleren Bereich der Zellen, wo der Kern zu sehen sind.
7. Richten Sie eine Zeitreihe von 10-20 konfokalen Bildern der Aufnahme eines Bildes alle 30 Sekunden.
8. Starten Sie den Zeitreihen.
9. Nach 2 Bilder aufgenommen werden (nach Ablauf der 30 Sekunden Zeit, Punkt), 1 mL des Medikaments (2X-Konzentration) sanft Drop-by-drop auf den Zellen mit einer Pipette P1000. Das Medikament wird kontinuierlich für etwa 30 Sekunden aufgenommen.
10. Einige Medikamente verursachen eine schnelle Translokation, die sichtbar sein können unmittelbar nach medikamentöse Behandlung (bei 60 Sekunden Zeitpunkt), während andere induzieren eine langsame Translokation, die nur optimal 5-10 Minuten nach der Behandlung (Movie 1 und Movie 2) ist.
11. Wenn das Medikament muss abgewaschen werden, verwenden Sie 2 x 10 ml Pipetten, um die Wäsche zu tun, Pipettieren Waschpuffer vorsichtig nach unten, mit einer Pipette auf der einen Seite des Tellers und Pipettieren bis die Medien auf der anderen Seite.
12. Wenn die Wäsche wirksam war und ob die Wirkung des Medikaments reversibel ist, kehrt PKC zurück zum Cytosol innerhalb von 30-60 Sekunden.
13. Speichern Sie den Film als LSM-Datei.
14. Verwenden NIH Image J Software, um die LSM-Dateien zu öffnen und zu quantifizieren, die Bilder vor und nach medikamentöser Behandlung. Die Quantifizierung wurde an anderer Stelle ¹ beschrieben.

Discussion

Wir haben eine Technik zur Bild Translokation von fluoreszenzmarkierten PKCs beschrieben in Echtzeit in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen. Sf9-Zellen bieten ein einfaches System, um Bild PKC-Translokation seit Kultivierung und Transfektion von ihnen ist ziemlich geradlinig. Im Gegensatz dazu nimmt die Mikroinjektion von Aplysia sensorischen Neuronen einiger Zeit zu meistern, bis zu einigen Monaten. Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dieser Technik gehören Elektrode verstopfen. Filterung der Injektionslösung und Zentrifugieren es in der Regel hilft aber manchmal Luftblasen in der Elektrode beim Befüllen es. Wir finden, dass mit dem Microloader Pipettenspitzen zum Auffüllen der Elektrode anstelle der Kapillarität hilft, die Bildung von Luftblasen zu minimieren. In Bezug auf Live-imaging, müssen zwei Faktoren fest während der Bildgebung Sitzung gesteuert werden: Temperatur und Bewegung. Temperaturschwankungen beeinflussen könnten, Translokation und die Verwendung einer temperierten Kammer sollte erwogen werden. Zur Vermeidung von Bewegung während der Bildgebung kann eine Schwingungsisolation Tabelle verwendet werden.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sf9 frozen cells	Spodoptera frugiperda ovarian cells	Invitrogen	B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11605-094	Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask	Tool	Corning	430720	Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum	Reagent	CanSera	CS-C08-500	Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe	Tool	BD Biosciences	309604	Use to filter Fast Green solution
Syringe	Tool	BD Biosciences	309602	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431229	Use to filter Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431212	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish	Tool	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent	Reagent	Invitrogen	10362-100	Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F-7252	Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Use to make micr–lectrodes for microinjection
Microloader pipette tip	Tool	Eppendorf	CA32950-050	Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump	Tool	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Part of microinjection station
Micr–lectrode holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Use to hold micr–lectrode
Micromanipulator	Tool	Sutter Instrument Co.	MP-85	Use to position micr–lectrode in the three-axis