Dissectie en kleuring van de Drosophila Larvale Eierstokken
Summary
Hoe niches en stamcellen vorm tijdens de ontwikkeling is een belangrijke vraag met praktische implicaties. In het<em> Drosophila</em> Eierstok, kiemlijn stamcellen en hun somatische niches vorm tijdens de larvale ontwikkeling. Deze video laat zien hoe te ontleden, vlekken en vrouwelijke gonaden de bevestiging uit het eind van de derde instar (LL3)<em> Drosophila</em> Larven.
Abstract
Veel organen zijn afhankelijk van stamcellen voor hun ontwikkeling tijdens de embryogenese en voor onderhoud of reparatie tijdens het volwassen leven. Te begrijpen hoe stamcellen vormen, en hoe ze omgaan met hun omgeving is daarom van cruciaal belang voor het begrijpen van de ontwikkeling, homeostase en ziekte. De eierstok van de fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft gediend als een invloedrijk model voor de interactie van kiembaan stamcellen (GSCs) met hun somatische ondersteuning cellen (niche) 1, 2. De bekende locatie van de niche en de GSCs, gekoppeld aan de mogelijkheid om genetisch manipuleren, heeft het mogelijk onderzoekers een groot aantal interacties tussen stamcellen en hun niches 3-12 toe te lichten.
Ondanks de overvloed aan informatie over de mechanismen die de SGR onderhoud en differentiatie, relatief weinig bekend over hoe GSCs en hun somatische niches vormen tijdens de ontwikkeling. Ongeveer 18 somatische niches, waarvan cellulaire componenten omvatten terminal filament en cap cellen (figuur 1), vormen tijdens het derde larvale instar 13-17. GSCs afkomstig uit primordiale kiemcellen (PGC). PGC's verspreiden zich in de vroege larvale stadia, maar na de vorming van de niche een subgroep van PGC's wordt GSCs 7, 16, 18, 19. Samen vormen de somatische niche cellen en de GSCs maken een functionele eenheid dat eieren produceert gedurende de hele levensduur van het organisme.
Veel vragen met betrekking tot de vorming van de SGR-eenheid blijven onbeantwoord. Processen, zoals de coördinatie tussen de voorloper cellen voor niches en stamcellen voorlopers, of het genereren van asymmetrie in PGC's naarmate ze GSCs, kan het beste worden bestudeerd in de larve. Echter, een methodische studie van de larvale ontwikkeling ovarium is fysiek uitdagend. Ten eerste larvale eierstokken zijn klein. Zelfs op late larvale stadia zij slechts 100 urn over te brengen. Daarnaast, de eierstokken zijn transparant en zijn ingebed in een wit dik lichaam. Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol voor het isoleren van de eierstokken van de late derde instar (LL3) Drosophila larven, gevolgd door kleuring met fluorescerende antilichamen. Wij bieden een aantal technische oplossingen voor problemen zoals het lokaliseren van de eierstokken, vlekken en het wassen van weefsels die niet zinken, en ervoor te zorgen dat de antilichamen doordringen in het weefsel. Dit protocol kan worden toegepast op eerdere larvale stadia en larven testes ook.
Protocol
Discussion
Deze video toont een isolement en kleuringsprotocol van de late derde instar larven eierstokken. Voor het uitvoeren van dit protocol routinematig en betrouwbaar, dient aandacht te worden besteed aan de volgende punten:
- Voor gesynchroniseerd en goed ontwikkelde larven, moet overbevolking worden vermeden.
- Om te voorkomen dat het verlies van de kleine doorzichtige eierstokken, zorg ervoor dat ontleden het vet lichaam intact. Dit zal ook helpen bij het lokaliseren van de eierstokken in de montage stad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IM wordt ondersteund door de Marie Curie re-integratie toe te kennen. Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Fonds Grant niet. 1146-1108, door de Helen en Martin Kimmel Instituut voor Stem Cell Research aan het Weizmann Institute of Science en de Leir Charitable Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | J.T.Baker | |||
| Kcl | Merck | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| MgCl2 | Merck | |||
| Sucrose | J.T.Baker | |||
| Hepes | Sigma-Aldrich | |||
| PBS | Sigma-Aldrich | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | |||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | ||
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | FST Fine Science Tools | 11295-10 | ||
| Nickel plated pin holder | FST Fine Science Tools | 26018-17 | ||
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | FST Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | CORNING | 7220-85 | ||
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica | |||
| 6 well plates | Costar | 3516 | ||
| Slides | Menzel Glaser GmbH | 798 | ||
| Cover slips | Corning | 2940-223 | ||
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | ||
| Cell strainer | Falcon | FAL352350 | ||
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | |||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | |||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | |||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | |||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
