Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların
Summary
Nişler ve kök hücre gelişimi sırasında formu nasıl pratik etkileri olan önemli bir soru. Giriş<em> Drosophila</em> Yumurtalık, germ line kök hücreleri ve somatik nişler larva gelişimi sırasında oluşturur. Bu video geç üçüncü instar (LL3) kadın gonadlar, teşrih leke ve monte etmek için nasıl gösterir<em> Drosophila</em> Larvaları.
Abstract
Birçok organların embriyogenez sırasında ve yetişkin ömrü boyunca bakım ve onarım için onların gelişimi için kök hücreleri bağlıdır. Onların çevre ile etkileşim kök hücre nasıl form ve nasıl olduğunu anlamak geliştirme, homeostaz ve hastalığı anlamak için bu nedenle çok önemlidir. Meyve sineği Drosophila melanogaster yumurtalık somatik destek hücreleri (niş) 1, 2 germ line kök hücreler (lerin) etkileşim için etkili bir model olarak görev yaptı. Genetik olarak onları manipüle etme yeteneği ile birleştiğinde, niş ve lerin bilinen yerde, araştırmacılar kök hücreleri ve nişler 3-12 arasındaki etkileşimleri çeşitli aydınlatmak için izin verdi.
GSC bakım ve farklılaşma kontrol mekanizmaları hakkında bilgi zenginliği rağmen, nispeten daha az lerin ve somatik nişler gelişimi sırasında formu hakkında bilinmektedir. Olan hücresel bileşenleri terminal filament ve kap hücreleri (Şekil 1), 13-17 sırasında instar üçüncü larva formu somatik nişler, yaklaşık 18. Lerin primordial germ hücrelerinin (PGCs) kaynaklanır. PGCs erken larva aşamasında çoğalırlar, ancak niş oluşumu takip PGCs bir alt lerin 7, 16, 18, 19 olur. Birlikte, somatik niş hücre ve lerin organizmanın ömrü boyunca yumurta üreten işlevsel bir birim.
GSC birim oluşumu ile ilgili birçok soru cevapsız kalmaktadır. Prekürsör hücreler, nişler ve kök hücre öncülleri veya lerin haline PGCs içinde asimetri nesil arasında koordinasyon gibi işlemler en iyi larva incelenebilir. Bununla birlikte, larva yumurtalık gelişme metodik bir çalışma, fiziksel olarak zordur. Birincisi, larva, yumurtalıklar küçük. Geç larva aşamasında bile onlar arasında sadece 100μm. Buna ek olarak, yumurtalıklar, şeffaf ve beyaz yağ vücut gömülü. Burada floresan antikorlar ile boyanarak takip geç üçüncü instar (LL3) Drosophila larvaları, yumurtalıklar izole etmek için bir adım-adım protokolünü açıklar. Biz, gibi sorunlar, yumurtalıkların yerini, lavabo değil doku boyama ve yıkama ve antikorlar doku içine nüfuz emin olun bazı teknik çözümler sunuyoruz. Bu protokol, daha önce larva aşamaları ve larva testisler gibi uygulanabilir.
Protocol
Discussion
Bu video geç üçüncü instar larva yumurtalıkların bir izolasyon ve boyama protokolü göstermektedir. Bu protokol rutin ve güvenilir yapmak için, dikkat, aşağıdaki noktalara dikkat edilmelidir:
- Senkronize ve iyi gelişmiş larvalar için, üzerinde kalabalık kaçınılmalıdır.
- Küçük saydam yumurtalıkların kaybını önlemek için, yağ vücut sağlam incelemek için emin olun. Bu aynı zamanda, özellikle (ikinci ya da üçüncü instar başında) genç yumurtalıklar montaj, mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sohbet Marie Curie yeniden bütünleşme hibe ile desteklenmektedir. Bu çalışma, İsrail Bilim Fonu Hibe No ile desteklenmiştir. 1146-1108, Helen ve Weizmann Bilim Enstitüsü Kök Hücre Araştırma ve Leir Vakfı Martin Kimmel Enstitüsü.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | J.T.Baker | |||
| Kcl | Merck | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| MgCl2 | Merck | |||
| Sucrose | J.T.Baker | |||
| Hepes | Sigma-Aldrich | |||
| PBS | Sigma-Aldrich | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | |||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | ||
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | FST Fine Science Tools | 11295-10 | ||
| Nickel plated pin holder | FST Fine Science Tools | 26018-17 | ||
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | FST Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | CORNING | 7220-85 | ||
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica | |||
| 6 well plates | Costar | 3516 | ||
| Slides | Menzel Glaser GmbH | 798 | ||
| Cover slips | Corning | 2940-223 | ||
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | ||
| Cell strainer | Falcon | FAL352350 | ||
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | |||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | |||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | |||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | |||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
