Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi
Summary
Metodi per l'imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l'imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.
Abstract
Imaging è una tecnica preziosa che può essere utilizzata per monitorare i processi biologici. In particolare, la presenza di cellule tumorali, cellule staminali, specifici tipi di cellule immunitarie, agenti patogeni virali, parassiti e batteri possono essere seguiti in tempo reale all'interno di animali viventi 1-2. Applicazione di imaging bioluminescenza per lo studio di agenti patogeni presenta vantaggi rispetto alle strategie tradizionali per l'analisi delle infezioni in modelli animali 3-4. Le infezioni possono essere visualizzati all'interno di un singolo animale, nel tempo, senza richiedere l'eutanasia per determinare la posizione e la quantità del patogeno. L'imaging ottico permette la visione completa di tutti i tessuti e organi, piuttosto che il campionamento dei siti precedentemente nota l'infezione. Inoltre, l'accuratezza della inoculazione in tessuti specifici possono essere direttamente determinato prima di portare gli animali in avanti che sono stati inoculati senza successo in tutto l'intero esperimento. Variabilità tra gli animali possono essere controllati per, dal momento che l'imaging permette ad ogni animale da seguire individualmente. Imaging ha il potenziale per ridurre notevolmente il numero degli animali necessari a causa della possibilità di ottenere dati da numerosi punti di tempo, senza dover tessuti campione per determinare il carico patogeno 3-4.
Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare le infezioni negli animali vivi utilizzando l'imaging bioluminescenza di ceppi di batteri ricombinanti che esprimono luciferasi. Lo scarabeo clic (CBRLuc) e luciferases lucciola (FFluc) utilizzano come substrato luciferina 5-6. La luce prodotta da entrambe le CBRluc e FFluc ha una lunghezza d'onda largo da 500 nm a 700 nm, rendendo questi giornalisti luciferases eccellente per l'imaging ottico in modelli animali che vivono 7-9. Ciò è dovuto soprattutto lunghezze d'onda della luce superiore a 600 nm sono necessari per evitare l'assorbimento da parte dell'emoglobina e, quindi, i viaggi attraverso il tessuto dei mammiferi in modo efficiente. Luciferasi è geneticamente introdotto i batteri per produrre segnale luminoso 10. I topi sono polmonare inoculati con batteri bioluminescenti intratracheally per consentire il monitoraggio delle infezioni in tempo reale. Dopo l'iniezione luciferina, le immagini sono acquisite con il Imaging System IVIS. Durante l'imaging, i topi vengono anestetizzati con isoflurano utilizzando un XGI-8 Sistema Gas Anethesia. Le immagini possono essere analizzati per localizzare e quantificare la sorgente del segnale, che rappresenta il sito di infezione batterica (s) e il numero, rispettivamente. Dopo l'imaging, la determinazione CFU viene effettuata sul tessuto omogeneizzato per confermare la presenza di batteri. Diverse dosi di batteri vengono utilizzati per correlare numeri batterica con luminescenza. L'imaging può essere applicato allo studio della patogenesi e la valutazione dell'efficacia di composti antibatterici e vaccini.
Protocol
Discussion
Anche se dopo questi protocolli di solito provoca immagini di alta qualità, è importante prendere in considerazione alcuni punti chiave per ottenere dati precisi e coerenti da studi di imaging. Luminescenza immagini dovrebbero essere acquisite che hanno conti da 600 a 60.000 per assicurare che il segnale è al di sopra di fondo e la fotocamera non è saturo. Se il segnale ottenuto è minore di 600 le condizioni di esposizione deve essere regolata per incrementare la conta. Se il segnale ottenuto è di oltre 60.000 la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i membri Cirillo laboratorio per le discussioni di valore e di assistenza in tutto questo studio. Ringraziamo il Dr. Joshua Hill e il laboratorio del Dr. James Samuel per assistenza durante le riprese di questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla borsa 48523 dalla Bill & Melinda Gates Foundation e concedere AI47866 dal National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isoflurane | VETONE | 501027 | ||
| Ketamine | Butler animal health supply | |||
| Xylazine | MP Biomedical | 158307 | ||
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | ||
| Fetal plus solution | VOR tech pharmaceutical | |||
| Cathether (22G x 1”) | TERUMO | OX2225CA | ||
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | ||
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | ||
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | |||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | |||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | |||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | |||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
References
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