نحن في هذا التقرير وصفا لطريقة لعزل وثقافة السلف المتخصصة الخلية من الكلى الماوس الجنينية التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم الجذعية / السلف خلايا الكلى النامية. هذه الخلايا المستزرعة متاحة للغاية لجزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسي ، والذي يسمح للتلاعب كفاءة الممرات مرشح.
وقد تم التطور الجنيني في الكلى درس على نطاق واسع على حد سواء باعتبارها نموذجا للتفاعل الظهارية – الوسيطة في organogenesis واكتساب فهم أصول أمراض الكلى الخلقية. في الآونة الأخيرة ، وقد تم دراسة إمكانية توجيه الخلايا الجذعية الجنينية من السذاجة تجاه مصائر كلوي الناشئة في مجال الطب التجديدي. وقد حددت الدراسات الجينية في الماوس عدة مسارات اللازمة للتنمية في الكلى ، وفهرس عالمي للنسخ الجيني في الجهاز وقد تم مؤخرا إنشاء http://www.gudmap.org/ ، وتوفير العديد من المنظمين مرشح للوظائف التنموية الأساسية. يمكن دراستها Organogenesis في الكلى القوارض في الثقافة الجهاز ، والعديد من التقارير قد استخدمت هذا الأسلوب لتحليل نتائج تطبيق إما بروتينات مرشح أو اسقاط التعبير عن الجينات باستخدام مرشح أو morpholinos سيرنا. ومع ذلك ، يقتصر تطبيق ثقافة الجهاز لدراسة الإشارات التي تنظم الجذعية / تمايز الخلايا السلف مقابل التجديد في الكلى كما تحتوي على أجهزة مثقف ميثاقا نشر المصفوفة خارج الخلية التي تحد من الجزيئات والجسيمات الفيروس. لدراسة الخلية إشارات الأحداث التي تؤثر على الساق / السلف الخلية المتخصصة في الكلى وضعنا نظام الخلية الأساسية التي تحدد منطقة كلوي أو السلف المتخصصة خلية من خلايا الجسم الحي الكلى السابقين النامية بمعزل عن محفز الظهارية للتمايز. باستخدام الهضم الأنزيمي محدودة ، يمكن الخلايا الكلوية منطقة تتحرر بشكل انتقائي من البلدان النامية في الكلى E17.5. بعد الترشيح ، يمكن هذه الخلايا مثقف بوصفه أحادي الطبقة غير النظامية به الظروف الأمثل. علامة تحليل الجينات يدل على أن هذه الثقافات تحتوي على توزيع أنواع الخلايا المميزة للمنطقة كلوي في الجسم الحي ، وأنها تحافظ على التعبير الجيني علامة المناسبة خلال الفترة الثقافة. هذه الخلايا هي سهلة الوصول إلى جزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسية ، مما يسهل كثيرا من دراسة الجذعية / آثار السلف مرشح منظم الخلية. يمكن المعلمات الخلية الأساسية البيولوجية مثل الانتشار النووي وموت الخلية ، وكذلك التغيرات في التعبير عن علامات مميزة الجزيئية للخلايا الجذعية / السلف نفرون في الجسم الحي واستخدمت بنجاح النتائج التجريبية. العمل الجاري في مختبرنا باستخدام هذه الرواية تقنية الخلية الأولية تهدف إلى الكشف عن الآليات الأساسية التي تحكم تنظيم التجديد الذاتي مقابل التمايز في الخلايا الجذعية / نفرون السلف.
في هذا البروتوكول وصفنا أسلوبا لعزل الخلايا والثقافة من منطقة كلوي في الكلى الجنينية. هو تطوير وسيلة نشر في البداية كجزء من دراسة لآثار العلاج على خلايا BMP7 المنطقة كلوي (فارغ وآخرون ، 2009). في الدراسة الأولية ، وأجريت سلسلة من التجارب لتحديد خصائص أنواع الخلايا مم…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من R01 DK078161 NIDDK (LO) ، زمالات ما بعد الدكتوراه من جمعية القلب الاميركية (AB) ، وأسس Wenner – جرين السويد وKungliga Fysiografiska Sällskapet ، لوند ، السويد (UB). وقدم دعم إضافي من قبل مركز أبحاث مين المعدات الطبية الأساسية معهد التشريح ، وعلم تكنولوجيا المعلومات الحيوي FACS (بدعم من 06 – 2P20RR18789) ومرفق MMCRI الحيوان.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
HBSS | Gibco | 14175 | ||
KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |