के लिए मानव luciferase टैग घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर कोशिकाओं के Orthotopic Xenografting Vivo में परीक्षण

Summary

मज़बूती से immunodeficient चूहों के sciatic तंत्रिका luciferase टैग मानव घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर कोशिकाओं में कलम बांधने का काम के लिए एक विधि का वर्णन है. bioluminescence इमेजिंग के प्रयोग के अध्ययन समूहों में पशुओं के यादृच्छिक अलगाव के लिए ट्यूमर और grafts के मापदंड के समुचित स्थापना का प्रदर्शन भी चर्चा कर रहे हैं.

Abstract

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug’s ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome¹and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.

Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period². However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)². Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.

Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 1³and most commonly arise in the sciatic nerve⁴. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Protocol

1. गैर नग्न immunodeficient चूहों (नंगा खींच लिए आवश्यक नहीं है) की प्रारंभिक तैयारी: सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की और अग्रिम में मंजूरी दे दी और UAB संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किए गए. हम सफलतापूर्वक इन प्रयोगों के लिए immunodeficient चूहों के तीन उपभेदों का इस्तेमाल किया है: एक) Foxchase SCID चूहों outbred (CB17/lcr- Prkdc चूहों / SCID lcrCrl); ख) एनआईएच III (NIHS Lyst bg Foxn1 परमाणु Brk xid चूहों) चूहों, और ग ) इशारा – चूहों SCIDγ (NOD.Cg Prkdc SCID Il2rg चूहों / tm1Wjl SzJ). हमारे हाथों में, orthotopic xenografts के विकास एनआईएच क्ष्क्ष्क्ष् और इशारा – SCIDγ चूहों, जो दोनों के टी कोशिकाओं बी कोशिकाओं और एन.के. कोशिकाओं के समारोह को प्रभावित परिवर्तन ले में लगभग समान है, इस प्रोटोकॉल के लिए दिनों की संख्या भ्रष्टाचार के लिए आवश्यक विकास, समय, जिस पर चिकित्सा शुरू की है और बार के बाद कलम बांधने का काम जब इमेजिंग प्रदर्शन किया है जो हम empirically इशारा – SCIDγ चूहों का उपयोग करने के लिए निर्धारित किया है. Foxchase में भ्रष्टाचार विकास SCID चूहों, जो टी और बी सेल समारोह में दोष है outbred, आम तौर पर अब लगता है. गैर नंगा immunodeficient चूहों की बड़ी संख्या की कलम बांधने का काम को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम दोपहर को शल्य साइट से बाल हटाने के कलम बांधने का काम करने के लिए पहले. चूहे एक isoflurane प्रेरण अपशिष्ट गैस के लिए मांजना के साथ एक vaporizer से जुड़ी कक्ष का उपयोग anesthetized हैं. शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए, पालतू जानवर की इस प्रक्रिया के दौरान एक हीटिंग पैड पर नियंत्रित किया जाता है. कतरनी मध्य वापस पक्ष में करने के लिए grafted जा रहा है पर हिंद पैर के घुटने के नीचे से बालों को हटाने के लिए उपयोग किया जाता है है. किसी भी शेष बाल ध्यान ~ 5 मिनट रासायनिक लोमनाशक एजेंट (जैसे नायर, संवेदनशील त्वचा के लिए मुसब्बर वेरा के साथ विशेष रूप से एक उत्पाद में) का उपयोग में साइट से हटा दिया है. लोमनाशक उत्पाद के हटाने के रूप में यह त्वचा, आंखों, और शरीर के अन्य सतहों जो यह फैल सकता है की जलन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की सिफारिश की है. हम भ्रष्टाचार इस दोनों के रूप में इन प्रयोगों में sciatic नसों द्विपक्षीय hindleg समारोह क्षीण कर सकते हैं नहीं, अध्ययन समूहों से चूहों के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप. चूहे पूरी तरह से बिस्तर के बिना एक अलग पिंजरे में एक हीटिंग पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति दी जाती है, यह दोनों सुनिश्चित करता है कि चूहों को अन्य, अधिक पूरी तरह से सतर्क जानवरों द्वारा नहीं घायल हुए हैं और उन्हें गलती से बिस्तर inhaling से रोकता है. जब चूहों पूरी तरह से मोबाइल हैं और पियक्कड़पन के कोई सबूत नहीं दिखा, वे दूसरे चूहों के साथ एक पिंजरे में पुनः शुरू किया जा सकता है. 2. इंजेक्शन के लिए MPNST कक्ष की कलम बांधने का काम के दिन पर तैयार इस प्रोटोकॉल में, कक्षों की विशिष्ट संख्या grafted और ट्यूमर के विकास के लिए आवश्यक समय के बाद कलम बांधने का काम जो हम empirically ST88-14 कोशिकाओं, आमतौर पर इस्तेमाल किया MPNST लाइन है कि एक NF1 जुड़े 5 ट्यूमर से प्राप्त किया गया के लिए निर्धारित किया है. कोशिकाओं हम कलम बांधने का काम के लिए उपयोग एक lentiviral वेक्टर युक्त एक कैसेट सीएमवी luciferase – IRES puromycin और क्लोन stably जुगनू luciferase 6 इमेजिंग bioluminescence द्वारा पहचान व्यक्त के साथ किया गया transduced है. हम भी MPNST stably सीएमवी तत्काल जल्दी प्रमोटर के नियंत्रण के तहत जुगनू luciferase व्यक्त plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ प्रयोगों कलम बांधने का काम किया है. हम यह सिफारिश नहीं है क्योंकि हमने पाया है कि इन प्लाज्मिड वैक्टर अभिव्यक्ति निम्नलिखित कलम बांधने का काम के विलुप्त होने से गुजरना करने के लिए प्रवण हैं. ST88-14 कोशिकाओं Dulbecco न्यूनतम आवश्यक 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 10 स्ट्रेप्टोमाइसिन μg / एमएल और 10 एमएल / आइयू पेनिसिलिन (DMEM10) के साथ पूरक माध्यम में बड़े हो रहे हैं, 5 puromycin / μg मिलीलीटर भी lentiviral वेक्टर के लिए चयन बनाए रखने के लिए शामिल है. हम अपनी प्रयोगशाला में इन कोशिकाओं को बनाए रखा है और 50 अंश के लिए इन passages के किसी भी सेल के विकास में मनाया किसी भी भिन्नता नहीं. 9 x 10 5 ST88-14 कोशिकाओं T175 फ्लास्क में चढ़ाया जाता है और 3 दिनों के लिए हो, पर जो बात फ्लास्क लगभग 80% मिला हुआ है. भ्रष्टाचार 35 चूहों के लिए एक एकल 80% मिला हुआ T175 कुप्पी की आवश्यकता है, इस घनत्व, हमारे ST88-14 कोशिकाओं के लिए औसत उपज 7.3 x 10 T175 फ्लास्क प्रति 6 कोशिकाओं है. यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को अनुमति नहीं दी जानी संगम के लिए कलम बांधने का काम के लिए कटाई बढ़ने से पहले. हमने पाया है कि कलम बांधने का काम कोशिकाओं को भ्रष्टाचार की विफलता के एक उच्च डिग्री में मिला हुआ बोतल परिणामों से काटा और अक्सर में भ्रष्टाचार विकास के vivo पाठ्यक्रम prolongs . ST88-14 कोशिकाओं को एक बार कमरे के तापमान हैंक्स संतुलित नमक समाधान के साथ rinsed हैं. कक्ष कमरे के तापमान पर 30 सेकंड 1 मिनट के लिए सेल खाल उधेड़नेवाला सेल हदबंदी समाधान का उपयोग कर कुप्पी से हटा रहे हैं. DMEM10 के पांच मिलीलीटर (नोट: puromycin इस माध्यम में शामिल नहीं है) सेल इस्तेमाल किया खाल उधेड़नेवाला के प्रत्येक प्रति मिली लीटर तो कोशिकाओं को जोड़ा है. कक्ष एक hemocytometer का उपयोग गिने जाते हैं. 5 x 10 3 ST88-14 3 μL में निलंबित कोशिकाओं माउस प्रति अंतःक्षिप्त किया जाएगा. Pipetting के लिए पूरी पलटन भ्रष्टाचार के लिए पर्याप्त भत्ता के साथ कोशिकाओं की एक मात्रात्रुटि (जैसे, 35 चूहों के लिए, हम आम तौर पर भ्रष्टाचार 40 चूहों के लिए पर्याप्त कक्षों की संख्या हस्तांतरण), एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित किया है. कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 3000 rpm पर centrifuged हैं. सतह पर तैरनेवाला ध्यान हटा दिया है और सेल गोली DMEM10 में resuspended (नोट: puromycin इस माध्यम में शामिल नहीं है) 3 μL प्रति 5 x 10 3 कक्षों की एक अंतिम एकाग्रता के लिए. बर्फ पर कोशिकाओं रखें. 3. प्रोटोकॉल कलम बांधने का काम चूहे एक isoflurane vaporizer के प्रेरण कक्ष में anesthetized हैं जब तक वे अब एक पैर के अंगूठे चुटकी प्रोत्साहन के लिए उनके hindlimb वापस लेने. चूहे उनके पक्ष में रखा जाता है और 0.05 मिलीग्राम / buprenorphine hydrocholoride किलो के साथ इंजेक्शन subcutaneously. संज्ञाहरण तो नाक शंकु के माध्यम से दिया isoflurane की निरंतर प्रशासन के माध्यम से बनाए रखा है. कृपया ध्यान दें कि एक euthanized चूहों वीडियो के लिए इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया गया था, फलस्वरूप, isoflurane isoflurane वितरित किया टयूबिंग वीडियो में दिखाई नहीं है. शरीर का तापमान बनाए रखने, पशुओं कलम बांधने का काम प्रक्रिया के दौरान एक हीटिंग पैड पर नियंत्रित किया जाता है. (Puralube पशु मरहम) corneal desiccation, नेत्र मरहम की एक छोटी सी बूंद को रोकने के हर आंख के लिए प्रशासित किया जाता है. जैसा कि यह प्रत्येक के लिए विशिष्ट परीक्षण भर में पहचाना जा माउस के लिए आवश्यक हो जाएगा, एक अद्वितीय पहचानकर्ता संख्या के साथ एक कान टैग प्रत्येक माउस के दाहिने कान के लिए काटा गया है. पेट पर रखें पशु, पिछले पैरों के प्रसार. कवर के साथ एक बाँझ टांगना माउस, शल्य चिकित्सा (पार्श्व) विंडो जहाँ जाएगा घटित कलम बांधने का काम उजागर. बाँझ टांगना सिर के दृश्य की अनुमति चाहिए, दोनों करने के लिए सुनिश्चित करें कि नाक शंकु के अंदर अभी भी है और श्वसन और जानवर का रंग की निगरानी की अनुमति. शल्य साइट betadine लागू के साथ एक कपास applicator इत्तला दे दी, पार्श्व के केंद्र में शुरू और शल्य विंडो के किनारों को धीरे – धीरे जावक चढ़ती. 70% इथेनॉल तो एक ही तरीके से शल्य साइट के लिए लागू है. इथेनॉल द्वारा पीछा betadine की लगातार अनुप्रयोगों दो बार दोहराया जाता है. बर्फ और या तो धीरे भंवर से कक्षों को निकालें या बस कोशिकाओं resuspend ट्यूब झटका. एक विंदुक का प्रयोग, सेल निलंबन के 3.2 μL हटाने और यह Parafilm के एक टुकड़े पर बेदखल करना. अधिक की जरूरत है को हटाने और Parafilm पर निलंबन रखने करके, हम है कि वहाँ निलंबन में कोई बुलबुले हैं सुनिश्चित करने और हम इंजेक्शन के लिए एक पूर्ण 3 μL है कि कर सकते हैं. एक 10 μL हैमिल्टन एक 33 गेज सुई के साथ सुसज्जित सिरिंज में के रूप में सेल निलंबन के जितना संभव हो खींचो. सिरिंज से झाड़ बुलबुले और ठीक तीन μL के लिए अतिरिक्त सेल निलंबन निष्कासित. पकड़ो बर्फ पर कोशिकाओं और सेल युक्त सिरिंज का उपयोग करने के लिए तैयार तक; करने के लिए सुनिश्चित करें कि सुई बाँझ रहता है, बर्फ या बाल्टी के साथ संपर्क की अनुमति नहीं देते. सरन लपेटो का एक टुकड़ा सीधे बर्फ संपर्क से सिरिंज के लिए बर्फ की चोटी पर रखा जा सकता है. एक नंबर 4 स्केलपेल संख्या 22 स्केलपेल ब्लेड के साथ सुसज्जित संभाल का प्रयोग दिशा की त्वचा के माध्यम से एक चीरा बस के नीचे और समानांतर जांध की हड्डी के लिए, सुनिश्चित करें कि चीरा शल्य चिकित्सा झाड़ी क्षेत्र की सीमाओं से परे का विस्तार नहीं करता है. एक शल्य चिकित्सा दबाना या मैन्युअल अंतर्निहित मांसपेशियों का पर्दाफाश के साथ त्वचा चीरा खोलें. एक fascial विमान पैर की लंबाई के साथ चल रहा है दिखाई देगा, sciatic तंत्रिका इस के नीचे और दो प्रावरणी से जुड़े हुए मांसपेशियों के बीच निहित है. तेज इत्तला दे दी कैंची की एक जोड़ी का उपयोग, कुंद इस प्रावरणी के माध्यम से काटना sciatic तंत्रिका, जो एक मोटी धागे की मोटाई के बारे में एक सफेद रैखिक संरचना के रूप में स्पष्ट किया जाना चाहिए का पर्दाफाश. तेज इत्तला दे दी घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग, ध्यान से तंत्रिका के तहत काटना, यह अंतर्निहित मांसपेशियों से ढीला, यह दोनों उठ और तंत्रिका आइसोलेट्स. इस स्थिति को बनाए रखने के तंत्रिका तहत संदंश छोड़ो. ध्यान से तंत्रिका में हैमिल्टन सिरिंज की सुई सम्मिलित करते हैं, करने के लिए संभव के रूप में तंत्रिका के साथ समानांतर के रूप में इंजेक्शन के कोण बनाए रखने ताकि सुई पंचर तंत्रिका के नीचे के माध्यम से नहीं है की कोशिश कर रहा है. सुई के लिए बाहर का तंत्रिका के अंत की ओर डाला जाना चाहिए रीढ़ – हमने पाया है कि रीढ़ की हड्डी की ओर तंत्रिका में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन रीढ़ की हड्डी को करीब निकटता में grafted ट्यूमर कोशिकाओं स्थापित है. जब ऐसा होता है, ट्यूमर कोशिकाओं को अक्सर रीढ़ की हड्डी पर आक्रमण, रीढ़ की हड्डी समारोह का समझौता होने के कारण अध्ययन समूह से जानवर के समय से पहले नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप. एक बार सुई ठीक तंत्रिका में तैनात है, संदंश द्वारा तंत्रिका में उत्पादित तनाव को आराम और धीरे धीरे तंत्रिका में सिरिंज से 45-60 सेकंड से अधिक कोशिकाओं इंजेक्षन. यह आवश्यक है कि यह धीरे धीरे के रूप में किया जा तेजी से सिरिंज सामग्री के निष्कासन "ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन साइट और उनके नुकसान के आसपास वापस धोने" में परिणाम होगा. के बाद सभी कोशिकाओं को सफलतापूर्वक अंतःक्षिप्त किया गया है, धीरे धीरे वापस लेने सुई इंजेक्शन सामग्री के नुकसान को कम करने के लिए. के लिए निकालेंceps और तंत्रिका सावधानी से अपनी मांसपेशियों के अंतर्गत मूल स्थान में वापस जगह है. Vetbond सर्जिकल गोंद के साथ शल्य चीरा को बंद करें. चीरा के साथ लगभग 20 सेकंड के लिए संदंश के साथ गोंद शुष्क करने की अनुमति पकड़ो. माउस isoflurane नाक शंकु से निकाल दिया जाता है और ठीक करने के लिए एक बिस्तर मुक्त पिंजरे में अकेले रखा. यह पिंजरा एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर रखा जाना चाहिए जब तक जानवर पूरी तरह से बरामद किया है. वसूली पिंजरे के भाग एक हीटिंग पैड पर नहीं होना चाहिए, यह जानवर गर्मी से दूर स्थानांतरित करने के लिए यदि वे भी गर्म हो की अनुमति देता है. कलम बांधने का काम के बाद, जानवरों साइट, लंगड़ापन या आहार चबाने के लिए नियमित रूप से मूल्यांकन किया जाना चाहिए, इन लक्षणों का संकेत मिलता है पशु अभी भी दर्द में है और कि उचित दर्दनाशक दवाओं को दी जानी चाहिए. इस प्रक्रिया के साथ अनुभव प्राप्त करने के बाद, हमने पाया है कि 30-40 चूहों को आसानी से एक ही दिन में grafted जा सकता है. 4. भ्रष्टाचार सफलता और randomization के अध्ययन समूह में आकलन Bioluminescence इमेजिंग कलम बांधने का काम प्रक्रिया की सफलता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम एक सिस्टम IVIS-100 (मूल Xenogen है, जो अब नली का व्यास इंक के रूप में जाना जाता है से) का उपयोग करने के लिए ट्यूमर व्यक्त जुगनू luciferase है कि अपने सब्सट्रेट, डी Luciferin साथ luciferase की रासायनिक प्रतिक्रिया का एक परिणाम के रूप में उत्पादन किया है से प्रकाश उत्सर्जन का पता लगाने . इन चित्रों के विश्लेषण से पता लगाएँ कि क्या विशिष्ट grafted चूहों चिकित्सीय परीक्षण के साथियों में प्रवेश के लिए उपयुक्त हैं. प्रारंभिक प्रयोगों में, हम bioluminescence detectable संकेत है, बलिदान grafted चूहों, ब्याज निर्माता लिविंग छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण के क्षेत्र से bioluminescence संकेतों के साथ उनके ट्यूमर और सहसंबद्ध ट्यूमर वजन काटा मात्रा निर्धारित है. इन अध्ययनों से दिखा दिया है कि वहाँ ट्यूमर भ्रष्टाचार वजन और bioluminescence प्रकाश उत्सर्जन के बीच एक रैखिक संबंध था, यह दर्शाता है bioluminescence इमेजिंग preclinical परीक्षण के पाठ्यक्रम में xenograft विकास का आकलन करने का एक उचित किराए मतलब है कि. आमतौर पर एक ही समय में हम 5 चूहों छवि. Bioluminescence इमेजिंग पर अतिरिक्त विवरण पहले 7 प्रकाशित किए गए थे. भ्रष्टाचार सफलता का आकलन करने के लिए, bioluminescence इमेजिंग 1 प्रदर्शन किया है और 3 दिन बाद कलम बांधने का काम. छवियाँ 2.5 डी Luciferin मिलीग्राम की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद ही स्थिति 10 मिनट में उन्मुख चूहों से एकत्र कर रहे हैं. इमेजिंग के दौरान, चूहों isoflurane संज्ञाहरण और उनके शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा Xenogen imager में मौजूद एक हीटिंग पैड के द्वारा के तहत रखा जाता है. छवि अधिग्रहण बार 2 सेकंड से 10 मिनट की रेंज में हैं, डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर सुनिश्चित करता है कि कोई पिक्सल छवि संग्रह के दौरान संतृप्त कर रहे हैं. ट्यूमर क्षेत्रों (रिश्तेदार फोटॉन मायने रखता है / सेक) से प्रकाश उत्सर्जन Xenogen से मालिकाना सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए मापा जाता है. लाइट उत्सर्जन तीव्रता bioluminescence कि चूहों कि एक ही समय में एकत्र कर रहे हैं के काले और सफेद तस्वीरों पर overlayed है pseudocolor स्केलिंग द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. एक preclinical परीक्षण काउहोट में शामिल करने के लिए पात्र होने के लिए, चूहों एक detectable bioluminescence संकेत दोनों 1 और 3 दिनों के बाद कलम बांधने का काम और bioluminescence संकेत की तीव्रता 1 और 3 दिनों के बीच में वृद्धि होगी होना चाहिए. पशु कि एक कम या स्थिर संकेत है अपवर्जित कर रहे हैं. इसके अलावा, एक ही दिन पर grafted चूहों में पाया संकेतों को एक दूसरे के परिमाण के एक आदेश के भीतर होना चाहिए, bioluminescence संकेत है कि उसी दिन पर grafted पशुओं में पाया की तुलना में कम या अधिक परिमाण के एक आदेश के साथ चूहों को भी बाहर रखा गया है. एक बार जब चूहों की पहचान की गई है कि इन मानदंडों को पूरा करने के लिए, वे उपचार समूहों में randomized होना चाहिए. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, luciferase grafted चूहों में पता चला संकेतों 3 दिन बाद कलम बांधने का काम पहले से उच्चतम सबसे कम तीव्रता के आदेश दिए हैं. चूहे कर रहे हैं तो समूहों में उपचार समूहों के लिए तीव्रता के क्रम में उन्हें बताए, इस आदेश के पीछे और फिर इस प्रक्रिया को दोहरा जब तक सभी चूहों समूहों को सौंपा जाता है यादृच्छिक. उदाहरण के लिए, अगर वहाँ 4 उपचार (जैसे, placebo, और परीक्षण दवा के तीन सांद्रता) समूहों चूहों आदेश 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 में समूहों को सौंपा , 4, 4, 3, 2, 1 .. आदि उपचार की शुरुआत से पहले, bioluminescence सौंपा समूह के प्रत्येक सदस्य में पता चला संकेतों यकीन है कि सभी समूहों के भीतर औसत प्रारंभिक संकेतों के रूप में संभव के रूप में में बंद कर रहे हैं बनाने के लिए औसत रहे हैं. उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंट के प्रशासन को 3 दिन शुरू कर दिया है. प्रभाव चिकित्सीय एजेंट उपचार के दौरान भ्रष्टाचार के विकास पर है का आकलन करने के लिए, bioluminescence इमेजिंग में एक बार शुरुआत उपचार के बाद एक सप्ताह (10 दिन, 17, 24, 30 के बाद कलम बांधने का काम) किया जाता है. गैर नंगा immunodeficient चूहों के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि जानवरों को फिर से नए फर नायर के साथ हटा प्रत्येक इमेजिंग सत्र के प्रदर्शन से पहले वृद्धि है. यह इसलिए है क्योंकि बाल bioluminescent संकेतों के कोट रंग के साथ निर्धारित कितना संकेत के खो दिया है ब्लॉक,. उदाहरण के लिए, जैसे सफेद फर स्विस डब्ल्यू पर पाया जाता हैebster चूहों bioluminescent संकेत तीव्रता 8 में एक 18% की कमी का उत्पादन, जबकि काले फर संकेतों 9 10 गुना के रूप में ज्यादा के रूप में कम कर सकते हैं. हम यह भी ध्यान रखें कि यह है कि वर्दी फर regrowth के सभी उपचार समूहों और "सामान्य" उपचार समूहों के बीच संकेत कटौती में घटित होगा नहीं माना जा सकता है. यह इसलिए है क्योंकि चिकित्सीय एजेंट ही बाल विकास को प्रभावित कर सकता है. उदाहरण के लिए, हम उल्लेख किया है कि tamoxifen उपचार बाल regrowth को रोकता है, जिससे ट्यूमर के विकास पर इस एजेंट की कथित प्रभाव को कम से कम जब placebo इलाज चूहों की तुलना में. ST88-14 MPNST कोशिकाओं के साथ चूहों 30 के बाद कलम बांधने का काम दिन के लिए किया जा सकता है. इस समय, ट्यूमर आमतौर पर अधिक से अधिक संस्थागत जानवरों की देखभाल और उपयोग समितियों के द्वारा की अनुमति आकार करने के लिए हो गए हैं और बलिदान होना चाहिए. अंतिम इमेजिंग सत्र के बाद, चूहों मारे गए हैं और नमूनों उपचार के परिणामों के आगे के विश्लेषण (उदाहरण के लिए, और चिकित्सीय एजेंट, वजन निर्धारण के लिए ट्यूमर ऊतक, ऊतक विज्ञान की परीक्षा Ki67 का निर्धारण और TUNEL के लेबलिंग सूचकांक के परिसंचारी स्तर के निर्धारण के लिए रक्त के लिए आवश्यक जैव रासायनिक मापदंडों का आकलन) एकत्र. संक्षेप में नमूनों एकत्र कर रहे हैं क्या प्रयोगात्मक डिजाइन की जरूरतों पर निर्भर करेगा. ट्यूमर के साथ चूहे दैनिक निगरानी किया जाना चाहिए समाप्त अगर वे बीमार हो जाते हैं (कमी सामान्य संवारने और परिहार व्यवहार), खाने या पीने में असमर्थ हैं, या अगर ट्यूमर पीढ़ी बड़े हो जाता है के रूप में सामान्य शरीर के आंदोलन में बाधा. ट्यूमर बोझ जानवर के सामान्य शरीर के वजन के 10% से अधिक की अनुमति नहीं मिलनी चाहिए. शरीर के वजन के एक प्रतिशत के रूप में ट्यूमर वजन / उम्र और सेक्स मिलान नियंत्रण जानवरों के वजन के ट्यूमर असर जानवरों के वजन की तुलना द्वारा की गणना है. कैचेक्सिया चिकित्सकीय महत्वपूर्ण हो नहीं दी जानी चाहिए. ट्यूमर असर पशुओं में वजन घटाने सामान्य शरीर के वजन के 20% से अधिक नहीं होनी चाहिए. 5. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1 दिखाता है bioluminescence में विशिष्ट प्रगतिशील वृद्धि मनाया 1 से 18 दिनों के बाद एक ठीक से स्थापित एक नग्न (एनआईएच III) माउस (एसी) में orthotopic xenograft में कलम बांधने का काम. Bioluminescence संकेतों की मात्रा का ठहराव पता चलता है कि, हालांकि इन संकेतों को उत्तरोत्तर वृद्धि, ट्यूमर के विकास को स्पष्ट रूप से अध्ययन अवधि (चित्रा 1D) के बाद के चरणों में accelerates कलम बांधने का काम 1-24 दिनों के बाद मनाया. कड़ाई से प्रदर्शित grafted चूहों में ट्यूमर के विकास हुआ है कि हम नियमित रूप से sciatic तंत्रिका इकट्ठा करने और, अगर यह प्रतीत होता है कि ट्यूमर epineurium उठी है और आसन्न ऊतकों पर आक्रमण किया, कोमल ऊतक और कंकाल की मांसपेशी के आसपास. MPNSTs की आक्रामक वृद्धि को देखते हुए, यह आश्चर्य की बात है कि हम अक्सर पाते हैं कि grafted ट्यूमर कोशिकाओं तंत्रिका की सामान्य बाधाओं का उल्लंघन किया है और आसन्न ऊतकों आक्रमण (चित्रा 1E) नहीं है. हम भी अक्सर पाते हैं कि grafted MPNST कोशिकाओं प्रॉक्सिमल और भ्रष्टाचार साइट के लिए बाहर का तंत्रिका में आक्रामक तरीके से विस्थापित. चित्रा 1 एनआईएच III माउस के bioluminescence इमेजिंग orthotopically luciferase टैग MPNST कोशिकाओं के साथ grafted 1 दिन बाद कलम बांधने का काम (ए). ध्यान दें कि विभिन्न चूहों में ब्याज की क्षेत्र (आरओआई) के भीतर पाया संकेतों को एक दूसरे के परिमाण के एक आदेश के भीतर सभी कर रहे हैं. Reimaging 10 (बी) के दिन और 18 दिन (सी) से पता चलता है कि bioluminescent संकेतों व्यक्तिगत चूहों में भ्रष्टाचार साइट पर उत्तरोत्तर वृद्धि के बाद कलम बांधने का काम. (डी) ग्राफ़ रिश्तेदार मायने रखता है फोटॉन / पोस्ट – कलम बांधने का काम 1-24 दिनों भ्रष्टाचार के साइट पर पाया दूसरी में उत्तरोत्तर वृद्धि illustrating. (ई) इस माउस से भ्रष्टाचार साइट के photomicrograph ट्यूमर और आसन्न कंकाल की मांसपेशी में फोकल आक्रमण विकास का प्रदर्शन.

Discussion

विस्तृत orthotopic xenografting विधि यहाँ प्रस्तुत है कि हम ST88-14 MPNST कोशिकाओं का उपयोग, एक लाइन है जो व्यापक रूप से इन NF1 जुड़े परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर के अध्ययन में प्रयोग किया जाता है विकसित है. हालांकि, इस पद्धति को आसानी से अन्य MPNST सेल लाइनों के साथ preclinical अध्ययन के लिए अनुकूल है. उदाहरण के लिए, हम भी orthotopic प्रदर्शन किया है xenografting अनुसूचित जनजातियों-26T ¹⁰ कोशिकाओं, एक कई मायनों घटनेवाला MPNST और T265-2c ¹¹ कोशिकाओं, जो एक NF1 जुड़े MPNST से निकाली गई है से व्युत्पन्न लाइन के साथ करने के लिए इसी तरह की सफलता है कि हम ST88 के साथ मनाया के साथ, -14 कोशिकाओं.

कर कहा है कि, हम ध्यान दें कि हम ST88-14 कोशिकाओं के orthotopic xenografting के लिए यहाँ वर्णन सटीक शर्तों को सीधे अन्य MPNST लाइनों की कलम बांधने का काम के लिए नहीं अपनाया जा सकता है. इसके बजाय, पद्धति का मुख्य मापदंडों empirically प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए निर्धारित होना चाहिए. इन मानकों MPNST कोशिकाओं की संख्या शुरू grafted, भ्रष्टाचार के विकास और एक हद तक कम करने के लिए, के लिए समय की अनुमति शामिल हैं, जो मात्रा में ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्ट कर रहे हैं. एक नई लाइन के लिए इन मानकों की स्थापना करने ^के लिए, हम 10 ³ से 5 x 10 6 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ चूहों (समूह 5 प्रति चूहों) के भ्रष्टाचार समूहों, परिमाण के ^{प्रत्येक} आदेश (यानी, 10 3 कोशिकाओं, 5 एक्स के लिए दो कक्षों की सांद्रता की जाँच 10 ³ कोशिकाओं, 10 ⁴ कोशिकाओं, 5 x 10 ⁴ कोशिकाओं, आदि). ट्यूमर कोशिकाओं (> 10 ⁶⁾ की बड़ी संख्या को एक बड़ी मात्रा में इंजेक्शन होना चाहिए, हमने पाया है कि 5 एमएल से grafted तंत्रिका कोशिकाओं की हानि के बिना इंजेक्शन जा सकता है. हम यह भी पाया है कि अधिक से अधिक 5 x 5 एमएल मात्रा प्रति ⁶ 10 ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में denser निलंबन तेजी कतरनी जो ट्यूमर कोशिकाओं को मारता के लिए प्रवण हो इंजेक्शन जा सकता है. हम इन चूहों का पालन करें जब तक प्रत्येक समूह के भीतर कम से कम तीन जानवरों स्पर्शनीय ट्यूमर है, जो बिंदु पर हम उस समूह को समाप्त करने और तंत्रिका histologically की जांच करने के लिए भ्रष्टाचार के विकास की पुष्टि है. सामान्य में, हम कोशिकाओं है कि 30-60 दिनों के भीतर अधिक से अधिक स्वीकार्य ट्यूमर के विकास तक पहुँच जाएगा के एक एकाग्रता की मांग कर रहे हैं, जाहिर है, समय तक पहुँचने के लिए इस बिंदु इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या के आधार पर अलग होगा की आवश्यकता है. और अधिक तेजी से विकास कर सकते हैं यह मुश्किल प्रभावी उपचार सांद्रता को प्राप्त करने के लिए प्रयोग और / की समाप्ति के पहले या प्रयोगों के पाठ्यक्रम पर पर्याप्त bioluminescence इमेजिंग datapoints के संग्रह को रोकने के. एक समय बेशक 60 दिनों की तुलना में अब प्रयोगात्मक मापदंडों बोझल समायोजन करता है और अनावश्यक योजना बनाई प्रयोगों की अवधि prolongs है.

अंत में, हम भी ध्यान दें कि हम ST88-14 NIH III के चूहों में ^grafted 6 tamoxifen के उपचारात्मक प्रभाव का प्रदर्शन कोशिकाओं के साथ इस orthotopic xenografting पद्धति का इस्तेमाल किया है. हम नियमित orthotopic xenografts पर उम्मीदवार चिकित्सात्मक एजेंटों के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग तरीकों की एक विस्तृत वर्णन है कि पांडुलिपि में पाया जा सकता है. यह भी दिखा दिया गया है कि neurofibroma कोशिकाओं को सफलतापूर्वक ^{परिधीय} तंत्रिका 12 में grafted जा सकता है, सुझाव है कि संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रक्रियाओं उम्मीदवार चिकित्सकीय neurofibromas के खिलाफ निर्देशित एजेंटों के साथ preclinical परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Foxchase outbred SCID mice		Charles River	#236
NIH III mice		Taconic	#NIHBNX
NOD-SCIDγ mice		Jackson Laboratories	#005557
Cell Stripper		Fisher Scientific	25-056-cl
Vetbond surgical glue		3M	1469SB
Hamilton syringe		Hamilton Company	#80030	10 μL volume
Hamilton syringe needles		Hamilton Company	#7803-05	33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)
Ear tags		National Band and Ear Tag Co.	1005-1
Ophthalmic ointment		Dechra	NDC 17033-211-38