مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك

Summary

هذا الأسلوب يصف جيل من الثقافات مخيخي عضوي النمط وتأثير المحفزات أفكارك معينة على جدوى مختلف أنواع الخلايا مخيخي.

Abstract

وقدم لأول مرة الثقافات عضوي النمط من الأنسجة العصبية التي هوغ ^1،2 في عام 1947 وشكلت اختراقا كبيرا في مجال علم الأعصاب. منذ ذلك الحين ، تم تطوير تقنية أخرى ، وحاليا هناك العديد من الطرق المختلفة لإعداد عضوي النمط الثقافات. قدم هنا كان الأسلوب مقتبس من واحد التي وصفها Stoppini آخرون لإعداد الشرائح وآخرون من Gogolla. الإجراء تلطيخ ^3،4.

ومن المزايا الفريدة لهذا الأسلوب هو أنه يتيح لك لدراسة أجزاء مختلفة من الدماغ مثل الحصين أو المخيخ في هيكلها الأصلي ، مما يوفر ميزة كبيرة على الثقافات التي نأت تتعطل كل شبكات الخلوي وتنظيم الخلايا العصبية. في حالة من المخيخ هو أكثر فائدة لأنها تتيح دراسة خلايا بركينيي ، من الصعب للغاية الحصول على والثقافة الأولية فصلها. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة ميزات تنموية معينة من المخيخ في المختبر ، فضلا عن التجارب الدوائية والكهربية في كل نوع البرية وفئرانا معدلة وراثيا.

وصف الأسلوب هنا تم تصميمه لدراسة تأثير المنبهات مثل أفكارك يجند فاس في المخيخ النامية ، وذلك باستخدام تلوين النفق لقياس أفكارك موت الخلية. إذا تم الجمع بين النفق تلطيخ مع نوع من الخلايا علامات محددة ، مثل Calbindin للخلايا بركينيي ، فمن الممكن لتقييم موت الخلايا في خلية بطريقة معينة من السكان. لتلطيخ Calbindin يخدم أيضا غرض تقييم نوعية الثقافات مخيخي.

Protocol

1. مخيخي الثقافات عضوي النمط : لتوليد بنجاح الثقافات مخيخي عضوي النمط استخدام الفئران بين P3 – P0 أو P8 P12. لدينا تجربة استخدمنا الفئران في مجموعة P8 – P12 لأن هذه المرحلة التنموية وأكثر ملاءمة لدراستنا. إعداد تشريح والمتوسطة الثقافة : وتنفذ تشريح الدماغ وإعداد شريحة في انخفاض الصوديوم السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) التي تحتوي على كلوريد الكالسيوم 1MM ، D – 10MM الجلوكوز ، 4mM كلوريد البوتاسيوم وكلوريد المغنيسيوم 5mM ، 26mM بيكربونات الصوديوم ، والسكروز 246mM والحل أحمر الفينول (1:1000) ، ودرجة الحموضة 7.3. لتعقيم الحل ، من خلال فلتر تصفية 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية. تستزرع شرائح للدماغ في 75 ٪ من الحد الأدنى الأساسي النسر متوسطة (MEM) ، و 25 ٪ مصل الحصان الحرارة المعطل ، HEPES 25mM ، 1MM الجلوتامين ، والجلوكوز 5mg / مل ، البنسلين (100 U / مل) والستربتوميسين (100 U / مل). تصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها أسبوعين. تشريح الدماغ في الجليد الباردة المتوسطة ACSF انفجر في وقت سابق مع كربوجين (95 ٪ أكسجين و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون) لاحظ ، من شأنها أن تشبع كربوجين مع تغيير الرقم الهيدروجيني من الحل لذلك سوف تحول من اللون الأحمر إلى البرتقالي. وينبغي إجراء التشريح في كمية وقت ممكن الدنيا والحرص على عدم الاضرار بنية الدماغ. شريحة الدماغ في الفروع من 400 ميكرومتر السهمي باستخدام vibratome. اجراء خفض السهمي بشفرة حلاقة في نصف الكرة الجنوبي ، في محاولة لخفض أقل قدر ممكن من المخيخ ، وهذا سيوفر على سطح مستو لتقطيع. وتستخدم القشرة فقط للحصول على الدعم لجعل التقطيع اسهل ولكن منذ زمن مسألة هامة وهو أكثر ملاءمة لقطع النصف من القشرة منقاري بشفرة حلاقة. استخدام cyanoacrylate (Superglue) لإصلاح الموقف من الدماغ على صفيحة معدنية vibratome. من المهم أن البرد لوحة على الجليد قبل إضافة الغراء وانتشاره بشكل جيد باستخدام غيض من أنبوب لتشكيل طبقة رقيقة لاصقة. إذا كان هناك فائض من Superglue ، فإنه سيتم فصل من لوحة عندما يتعلق الأمر في اتصال مع وACSF ستفقد العينة. مرة واحدة متصلة الدماغ إلى لوحة vibratome ، إضافة إلى ما يكفي من وسائل الاعلام ACSF تغطي الدماغ ووضع تحت الجليد لوحة لإبقائها باردة. قطع شرائح 400 ميكرون ونقل لهم ماصة باستير البلاستيك (قطع رأس لتوسيع وتفادي الأضرار التي لحقت شرائح) لوحة خلية ثقافة 6 – جيدا ACSF تحتوي على الجليد. فصل المخيخ عن بقية الدماغ بمساعدة الأنسولين المحاقن اثنين (المحاقن مع القطر الصغير عيار 28 إبر) تحت مجهر تشريح. وسوف يكون بعض شرائح Superglue تعلق على الحواف : هذا هو لحظة في محاولة لإزالته لأنها يمكن أن تؤثر على بقاء شريحة. من المهم أن تفعل ذلك دون الإضرار بعناية هيكل مخيخي. نقل إلى 6 شرائح مخيخي رفاه لوحات تحتوي على لوحة 30mm إدراج الثقافة مع مسام ميكرون 0.4. إضافة 1 مل من وسائل الاعلام في الثقافة أيضا ، التي كانت ما قبل الحضانة مشروطا لمدة لا تقل عن 2 ساعة على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 (في ثقافة الخلية الحاضنة). مكان يدرج على رأس وسائل الإعلام التأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحتبسة تحت ثم ضع شرائح مخيخي (1-3 في إدراج) على رأس إدراج التأكد يتم توسيع بشكل كامل ، وأنه لا يغطي السائل منها. نضح الزائدة من وسائل الإعلام إذا لزم الأمر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل يوم 2 أو 3. فمن الأفضل أن تحل محل جزء فقط من المتوسط ​​(على سبيل المثال حجم ونصف) في آن واحد ، لأن الوسيلة المستخدمة تحتوي على العوامل الغذائية المشتقة من شريحة التي تعتبر مهمة لبقاء الخلية. 2. معالجة فاس وتلون شرائح مخيخي : للتجربة التحدي أفكارك ، ونحن أول من ثقافة شرائح لمدة 5 أيام المتغيرة وسائل الاعلام يوم في المختبر 3 (DIV3). يمكن DIV5 على الثقافات وتعامل مع 0.5 ميكروغرام / مل من الأضداد Jo2 فاس ناهض عن طريق إضافته مباشرة إلى وسائل الإعلام من أجل الحصول على خلفية نظيفة من موت الخلية منذ التغييرات من وسائل الإعلام لحث بعض الوفيات في الثقافات. يتم ترك نصف الآبار غير المعالجة والتحكم. بعد 24 ساعة إزالة وسائل الاعلام تحت إدراج بواسطة الشفط. لإصلاح الشرائح ، إضافة 1 مل من الجليد الباردة PFA 4 ٪ و 1 مل تحت فوق إدراج. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقيقة إزالة PFA وتغسل لفترة وجيزة مع PBS الباردة. إزالة المقبل في برنامج تلفزيوني وإضافة (1) وتحت مل مل (1) أعلاه إدراج من الميثانول الجليد الباردة بنسبة 20 ٪ في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل و 1 مل تحت فوق إدراج 0.5 ٪ تريتون 100 – X في برنامج تلفزيوني عن permeabilization. احتضان مدة لا تقل عن 12 ساعة في 4 درجات مئوية. بعد permeabilization ، كتلة مع جيش صرب البوسنة 20 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة لا تقل عن4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. ويمكن في هذه المرحلة أن تبقى الشرائح في حل حجب ما لا يقل عن 3 أيام في 4 درجات مئوية. من أجل خفض وصمة عار على شرائح بعناية قطعة من الغشاء إدراج تعلق على شريحة مخيخي وتحويلها إلى 24 لوحات جيدة تحتوي على برنامج تلفزيوني. تتم immunostaining بالتسلسل ، الأولى مع كاشف النفق لمدة ساعة ثم مع Calbidin الأضداد بين عشية وضحاها. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميكرولتر كاشف قبالة النفق في كل القرارات كذلك التأكد من أنها تغطي كامل سطح الشريحة. في احتضان 37 درجة مئوية لمدة ساعة في الظلام. بعد ساعة واحدة إزالة مزيج النفق ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. بعد غسل الماضي ، إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميليلتر من تخفيف 1 / 1000 من الأجسام المضادة Calbindin في برنامج تلفزيوني واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام. الحل إزالة الأجسام المضادة الأولية ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. إضافة المخفف 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية 1 / 500 في برنامج تلفزيوني واحتضان ما لا يقل عن ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة في الظلام. هو المسمى عدة النفق كنا مع أحمر TMR ، وبالتالي لدينا جسم الثانوية لغير مترافق Calbindin إلى اليكسا – 488. يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني وتحميل الشرائح على شريحة ميكروسكوب زجاجية باستخدام وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي دابي. صورة مع شرائح المجهر مبائر باستخدام 488 نانومتر و 561 نانومتر wavelenght الإثارة لCalbindin والنفق على التوالي. 3. ممثل النتائج : التحدي الرئيسي لهذا البروتوكول هو أن تكون قادرة على توليد صحية الثقافات شريحة المخيخ ، وخصوصا قراءات هدفنا النهائي سيكون موت الخلية. ثقافة صحية كما يبدو واحد حيث طبقة شفافة من خلايا الجسم ، ويسمح لك أن ترى هيكل ورقي من المخيخ تحت المجهر (الشكل 1). ويمكن ملاحظة بعد أيام قليلة في الثقافة شرائح رقيقة تبدأ الخلايا العصبية ، وغير المهاجرة بعيدا عن هامش شريحة. والخلايا الجولة الظلام (الضامة الأرجح) التي تغطي شرائح بعد أيام قليلة في الثقافة ، وانخفاض في نهاية المطاف في عدد بعد 10-14 يوما في المختبر (الشكل 2) 5. والدليل القاطع لبقاء شرائح هو وصمة عار للعلامات الخلوية المختلفة ، مثل Calbindin للخلايا بركينيي. ويبين الشكل 3 ممثل صورة المجهر مبائر طبقة بركينيي بنواة خلية النفق عدة إيجابية. من المهم أن نرى أن بعض الشرائح حتى لو حصل على التحفيز أفكارك ، إلا أنهم تعرضوا لمدة 24 ساعة. هذا يسمح الوقت الكافي لمراقبة تجزئة الحمض النووي في الخلايا الميتة مع تلوين النفق ، ولكن خلية بركينيي طبقة محددة لا تزال موجودة. الشكل 1. شريحة مخيخي DIV2 صحية في هذه الصورة تظهر خلايا الجسم طبقة شفافة وهيكل ورقي للدماغ في شريحة صحية. الشكل 2. مخيخي شريحة صحية في DIV 7. وفي هذه الصورة يمكننا أن نلاحظ ما زال هيكل ورقي من المخيخ وظهور هيئات زنزانة مظلمة. الشكل 3. صورة ممثل شريحة المعالجة مخيخي فاس ، وهذا يدل على صورة مبائر خلايا بركينيي ملطخة Calbindin (الخضراء) والخلايا أفكارك إيجابية لتلطيخ النفق (الحمراء). خلايا بركينيي لا تظهر في صف واحد ولكن تتجمع تشكيل هيكل folium الشبيهة.

Discussion

يصف هذا الأسلوب واحد من التطبيقات الممكنة العديد من الثقافات عضوي النمط العصبية وانه سمح لنا لدراسة تأثير المنبهات أفكارك في نوع البرية وشرائح مخيخي متحولة.

أهم جزء من هذه التجربة هو أن تكون قادرة على توليد باستمرار صحية الثقافات شريحة مخيخي. العوامل الرئيسية هي تشريح وتقطيع والتقنية والقدرة على تنفيذ البروتوكول في أقل وقت ممكن ، ولكن في نفس الوقت الحرص على عدم الاضرار الشرائح. عامل آخر بالغ الأهمية يتمثل في إعداد وتكوين وسائل الإعلام والثقافة ، وهذه الثقافات هي حساسة للغاية ، لذلك اضطررنا لاختبار عدة وصفات والعلامات التجارية من وسائل الإعلام. حتى يمكن دفعات مختلفة من المصل أو أي مكونات أخرى من وسائل الاعلام تؤثر على صلاحية الشرائح. حصلنا على أفضل النتائج مع المصل من الخيل لوط Invitrogen # 480116.

حالما يتم إنشاء شرائح مخيخي يمكن للمرء أن دراسة تطوير مخيخي ، الكهربية ، وبقاء الخلية وحدها أو استجابة لمنبهات أفكارك ، أو الحرمان excitotoxicity الأوكسجين. وقد تم إجراء دراسات مقارنة باستخدام نوع البرية وشرائح مخيخي متحولة الثاقبة للغاية في كثير من جوانب وظيفة المخيخ والتنمية.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
MEM		Invitrogen	11090
Horse Serum		Invitrogen	16050
Hepes		Invitrogen	15630
Glutamine		Invitrogen	25030
Penicillin/ Streptomycin		Invitrogen	15140
Superglue		Krazy Glue
6 well / 24 well cell culture plates		Corning Incorporated	3506/ 3527
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore)		Millipore	PICM03050
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2)		BD Pharmingen	554254
In situ cell death detection kit, TMR red		Roche	12 156 792 910
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody		Swant	CB-38a
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody		Invitrogen (Molecular probes)	A-11008
Vectashield Mounting Medium with DAPI		Vector labs	H-1200
Dissecting Microscope		Zeiss Stemi SV 11
Vibratome		Leica
Confocal Microscope		Leica TCS SP2 AOBS