واحد المجهر الإلكتروني التعمير الجسيمات مجمع Exosome باستخدام أسلوب عشوائي الخيمة المخروطية
Summary
توضح هذه المقالة أسلوب قياسي للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة بناء الجزيئات البيولوجية باستخدام المجهر الإلكتروني تلطيخ السلبية (EM). في هذا البروتوكول ، ونشرح كيفية الحصول على هيكل 3D من exosome السكيراء مجمع البيرة في قرار عشوائي المتوسطة باستخدام أسلوب إعادة الإعمار الميل المخروطية (RCT).
Abstract
واحد المجهر الإلكتروني الجسيمات (EM) إعادة الإعمار وأصبح أداة شعبية في الآونة الأخيرة للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) هيكل المجمعات الجزيئات الكبيرة. بالمقارنة مع البلورات بالأشعة السينية ، فإنه لديه بعض مزايا فريدة. أول واحد الجسيمات EM إعادة الإعمار ليست في حاجة لبلورة نموذج البروتين ، والذي هو عنق الزجاجة في البلورات بالأشعة السينية ، وخاصة بالنسبة للمجمعات الجزيئات الكبيرة. وثانيا ، أنها لا تحتاج إلى كميات كبيرة من عينات البروتين. بالمقارنة مع ملليغرام من البروتينات اللازمة لبلورة واحدة التعمير EM يحتاج فقط الجسيمات الدقيقة عدة لترات من محلول البروتين في تركيزات نانو المولي ، وذلك باستخدام أسلوب تلطيخ السلبية EM. ومع ذلك ، على الرغم من الجمعيات القليلة التي تماثل الجزيئات عالية ، جسيم واحد هو EM محدودة في دقة منخفضة نسبيا (أقل من 1 نانومتر القرار) لعينات كثيرة لا سيما تلك دون التماثل. وتقتصر هذه التقنية أيضا حسب حجم الجزيئات قيد الدراسة ، أي 100 كيلو دالتون لعينات الملون سلبيا و300 كيلو دالتون لعينات مجمدة رطب بشكل عام.
لعينة جديدة من الهيكل غير معروف ، ونحن عموما استخدام المعادن الثقيلة حل لتضمين الجزيئات التي تلطيخ السلبية. ثم يتم فحص العينة في انتقال مجهرا الكترونيا لاتخاذ ثنائي الأبعاد (2D) micrographs من الجزيئات. من الناحية المثالية ، وجزيئات البروتين وبنية متجانسة 3D كنه يحمل توجهات مختلفة في micrographs. يتم ترقيم هذه micrographs ومعالجتها في أجهزة الكمبيوتر باسم "الجزيئات واحدة". ثنائي الأبعاد باستخدام المحاذاة وتقنيات التصنيف ، تتجمع جزيئات متجانسة في نفس وجهات النظر إلى طبقات. المتوسطات على تعزيز إشارة من الأشكال الجزيء 2D. بعد أن تعيين جسيمات ذات التوجه النسبي الصحيح (زوايا أويلر) ، سنكون قادرين على إعادة بناء الصور في حجم الجسيمات 2D 3D ظاهري.
في واحد الجسيمات 3D إعادة الإعمار ، هو خطوة ضرورية لتعيين بشكل صحيح التوجه السليم لكل جسيم واحد. هناك عدة طرق لتعيين عرض لكل جسيم ، بما في ذلك إعادة الزاوي (1) والميل عشوائي المخروطية (RCT) الأسلوب 2. في هذا البروتوكول ، وصفنا ممارستنا في الحصول على إعادة الإعمار 3D المعقدة باستخدام الخميرة exosome السلبية EM تلطيخ وRCT. وتجدر الإشارة إلى أن لدينا بروتوكول المجهر الإلكتروني ومعالجة الصور يتبع المبدأ الأساسي لRCT ولكن ليست الطريقة الوحيدة لتنفيذ هذه الطريقة. علينا أولا كيف تصف لتضمين عينة البروتين إلى طبقة من ثاني اكسيد اليورانيوم فورمات – بسماكة مماثلة لحجم البروتين ، وذلك باستخدام الشبكة الكربون holey مغطاة بطبقة من الكربون رقيقة فيلم المستمر. ثم يتم إدخال العينة إلى انتقال مجهرا الكترونيا لجمع untilted (0 درجة) ويميل (55 درجة) زوجا من micrographs التي سيتم استخدامها لاحقا لتجهيز والحصول على النموذج الأولي لل3D exosome الخميرة. ولهذه الغاية ، نقوم RCT ثم صقل النموذج الأولي 3D باستخدام طريقة الإسقاط مطابقة التنقيح 3.
Protocol
Discussion
في هذا المقال نقدم بروتوكول مفصل لإعداد نموذج إعادة الإعمار وثلاثة الأبعاد للمجمع exosome السلبية باستخدام المجهر الإلكتروني تلطيخ. باستخدام هذه الطريقة ، حصلنا على اعادة اعمار 3D باستخدام طريقة عشوائية الميل المخروطية دون أي علم مسبق للهيكل. عشوائية طريقة الميل المخر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء نوغاليس مختبر في جامعة كاليفورنيا في بيركلي في المساعدة على إنشاء بروتوكولات الأولية وأعضاء وانغ مختبر في جامعة ييل في مساعدتهم لوضع بروتوكولات كاملة. نعترف أيضا من العاملين في البرد EM المرفق وعالية الأداء مركز الحاسوب في كلية ييل للطب لدعمهم. الأب هو رست سميث الأسرة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Science | 63450-15-7 | ||
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Science | 22451 | ||
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientist | 4951F-001 | ||
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | ||
| Carbon coater Auto 306 | Edwards | |||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | |||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
References
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification – powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3′ end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
