توضح هذه المقالة أسلوب قياسي للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة بناء الجزيئات البيولوجية باستخدام المجهر الإلكتروني تلطيخ السلبية (EM). في هذا البروتوكول ، ونشرح كيفية الحصول على هيكل 3D من exosome السكيراء مجمع البيرة في قرار عشوائي المتوسطة باستخدام أسلوب إعادة الإعمار الميل المخروطية (RCT).
واحد المجهر الإلكتروني الجسيمات (EM) إعادة الإعمار وأصبح أداة شعبية في الآونة الأخيرة للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) هيكل المجمعات الجزيئات الكبيرة. بالمقارنة مع البلورات بالأشعة السينية ، فإنه لديه بعض مزايا فريدة. أول واحد الجسيمات EM إعادة الإعمار ليست في حاجة لبلورة نموذج البروتين ، والذي هو عنق الزجاجة في البلورات بالأشعة السينية ، وخاصة بالنسبة للمجمعات الجزيئات الكبيرة. وثانيا ، أنها لا تحتاج إلى كميات كبيرة من عينات البروتين. بالمقارنة مع ملليغرام من البروتينات اللازمة لبلورة واحدة التعمير EM يحتاج فقط الجسيمات الدقيقة عدة لترات من محلول البروتين في تركيزات نانو المولي ، وذلك باستخدام أسلوب تلطيخ السلبية EM. ومع ذلك ، على الرغم من الجمعيات القليلة التي تماثل الجزيئات عالية ، جسيم واحد هو EM محدودة في دقة منخفضة نسبيا (أقل من 1 نانومتر القرار) لعينات كثيرة لا سيما تلك دون التماثل. وتقتصر هذه التقنية أيضا حسب حجم الجزيئات قيد الدراسة ، أي 100 كيلو دالتون لعينات الملون سلبيا و300 كيلو دالتون لعينات مجمدة رطب بشكل عام.
لعينة جديدة من الهيكل غير معروف ، ونحن عموما استخدام المعادن الثقيلة حل لتضمين الجزيئات التي تلطيخ السلبية. ثم يتم فحص العينة في انتقال مجهرا الكترونيا لاتخاذ ثنائي الأبعاد (2D) micrographs من الجزيئات. من الناحية المثالية ، وجزيئات البروتين وبنية متجانسة 3D كنه يحمل توجهات مختلفة في micrographs. يتم ترقيم هذه micrographs ومعالجتها في أجهزة الكمبيوتر باسم "الجزيئات واحدة". ثنائي الأبعاد باستخدام المحاذاة وتقنيات التصنيف ، تتجمع جزيئات متجانسة في نفس وجهات النظر إلى طبقات. المتوسطات على تعزيز إشارة من الأشكال الجزيء 2D. بعد أن تعيين جسيمات ذات التوجه النسبي الصحيح (زوايا أويلر) ، سنكون قادرين على إعادة بناء الصور في حجم الجسيمات 2D 3D ظاهري.
في واحد الجسيمات 3D إعادة الإعمار ، هو خطوة ضرورية لتعيين بشكل صحيح التوجه السليم لكل جسيم واحد. هناك عدة طرق لتعيين عرض لكل جسيم ، بما في ذلك إعادة الزاوي (1) والميل عشوائي المخروطية (RCT) الأسلوب 2. في هذا البروتوكول ، وصفنا ممارستنا في الحصول على إعادة الإعمار 3D المعقدة باستخدام الخميرة exosome السلبية EM تلطيخ وRCT. وتجدر الإشارة إلى أن لدينا بروتوكول المجهر الإلكتروني ومعالجة الصور يتبع المبدأ الأساسي لRCT ولكن ليست الطريقة الوحيدة لتنفيذ هذه الطريقة. علينا أولا كيف تصف لتضمين عينة البروتين إلى طبقة من ثاني اكسيد اليورانيوم فورمات – بسماكة مماثلة لحجم البروتين ، وذلك باستخدام الشبكة الكربون holey مغطاة بطبقة من الكربون رقيقة فيلم المستمر. ثم يتم إدخال العينة إلى انتقال مجهرا الكترونيا لجمع untilted (0 درجة) ويميل (55 درجة) زوجا من micrographs التي سيتم استخدامها لاحقا لتجهيز والحصول على النموذج الأولي لل3D exosome الخميرة. ولهذه الغاية ، نقوم RCT ثم صقل النموذج الأولي 3D باستخدام طريقة الإسقاط مطابقة التنقيح 3.
في هذا المقال نقدم بروتوكول مفصل لإعداد نموذج إعادة الإعمار وثلاثة الأبعاد للمجمع exosome السلبية باستخدام المجهر الإلكتروني تلطيخ. باستخدام هذه الطريقة ، حصلنا على اعادة اعمار 3D باستخدام طريقة عشوائية الميل المخروطية دون أي علم مسبق للهيكل. عشوائية طريقة الميل المخر?…
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء نوغاليس مختبر في جامعة كاليفورنيا في بيركلي في المساعدة على إنشاء بروتوكولات الأولية وأعضاء وانغ مختبر في جامعة ييل في مساعدتهم لوضع بروتوكولات كاملة. نعترف أيضا من العاملين في البرد EM المرفق وعالية الأداء مركز الحاسوب في كلية ييل للطب لدعمهم. الأب هو رست سميث الأسرة.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Science | 63450-15-7 | ||
Uranyl Formate | Electron Microscopy Science | 22451 | ||
Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientist | 4951F-001 | ||
400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | ||
Carbon coater Auto 306 | Edwards | |||
Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | |||
Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |