Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar
Summary
Bu makale, negatif boyama elektron mikroskobu (EM) kullanarak biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu (3B) rekonstrüksiyonu almak için standart bir yöntem açıklanır. Bu protokolde, rasgele konik eğim rekonstrüksiyon yöntemi (RCT) ile orta çözünürlükte Saccharomyces cerevisiae exosome kompleks 3D yapısı nasıl açıklayabilir.
Abstract
Tek parçacık elektron mikroskobu (EM) yeniden yapılanma büyük makromoleküler kompleksleri, üç boyutlu (3D) bir yapı elde etmek için son zamanlarda popüler bir araç haline gelmiştir. X-ışını kristalografisi ile karşılaştırıldığında, bazı benzersiz avantajlar vardır. İlk olarak, tek bir parçacık EM yeniden yapılanma, özellikle büyük makromoleküler kompleksleri için X-ışını kristalografisi darboğaz protein örnek, kristalize değildir. İkincisi, büyük miktarda protein örneklerinin gerek yoktur. Kristalizasyon için gerekli proteinlerin miligram ile karşılaştırıldığında, tek parçacık EM yeniden yapılanma sadece negatif boyama EM yöntemi kullanarak nano-molar konsantrasyonlarda protein çözüm çeşitli mikro-litre ihtiyacı var. Ancak, yüksek simetri birkaç makromoleküler meclisleri olmasına rağmen, tek bir parçacık EM özellikle de simetri olmadan birçok örnekler için (1 nm den daha düşük çözünürlük) nispeten düşük çözünürlükte sınırlıdır. Bu teknik, aynı zamanda çalışmanın altında moleküllerin büyüklüğü ile sınırlıdır, yani genel olarak dondurulmuş sulu numuneler için olumsuz lekeli örnekleri ve 300 kDa 100 kDa.
Yapısı bilinmeyen yeni bir örnek için, genelde negatif boyama ile moleküller gömmek için bir heavy metal çözümü kullanın. Daha sonra örnek moleküllerin iki boyutlu (2D) mikrograflar almak için bir transmisyon elektron mikroskopta incelenir. İdeal olarak, protein molekülleri, homojen bir 3D yapıya sahip ancak farklı yönelimleri mikrograflar gösterirler. Bu mikrograflar "tek parçacıklar" olarak sayısallaştırılmış ve bilgisayarlara işlenir. Iki boyutlu bir uyum ve sınıflandırma teknikleri kullanarak, aynı görüşleri homojen moleküllerin sınıfa kümelenmiş. Onların ortalamalar molekülün 2D şekilleri sinyal artırır. Biz doğru bağıl yönelimi (Euler açıları) parçacıklar atadıktan sonra, biz, 2 boyutlu, 3 boyutlu bir sanal hacmin içine parçacık görüntüleri yeniden inşa etmek mümkün olacak.
Tek parçacık 3D rekonstrüksiyon, önemli bir adım, tek tek her parçacığın uygun yönlendirmeyi doğru atamak. Açısal sulandırıldıktan 1 ve rastgele konik tenteli (RCT) yöntem 2 de dahil olmak üzere, her parçacık görünümü atamak için çeşitli yöntemler vardır. Bu protokol, maya exosome kompleksi negatif boyama EM ve RCT kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon almak bizim uygulama açıklar. Elektron mikroskobu ve görüntü işleme protokol RCT temel prensibi izler ama yöntemi gerçekleştirmek için tek yol olduğunu belirtmek gerekir. Önce, sürekli ince bir karbon film tabakası ile kaplı bir holey karbon ızgarası kullanılarak, uranil-biçimleri protein boyutu ile karşılaştırılabilir bir kalınlığında bir tabaka haline protein örnek gömmek nasıl açıklar. Sonra örnek toplamak için bir transmisyon elektron mikroskobu eklenir untilted (0 derece) ve işleme ve maya exosome bir ilk 3D model elde etmek için daha sonra kullanılabilir olacak mikrograflar eğimli (55 derece) çifti. Bu amaçla, biz RCT gerçekleştirmek ve daha sonra arıtma yöntemini 3 uyan projeksiyon kullanarak ilk 3D model rafine .
Protocol
Discussion
Bu yazıda, numune hazırlama, ayrıntılı protokol ve negatif boyama elektron mikroskobu kullanarak exosome kompleks üç boyutlu rekonstrüksiyon sunuyoruz. Bu yöntemi kullanarak, yapının herhangi bir ön bilgi olmadan rastgele konik eğim yöntemi kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon aldı. Rastgele konik eğim yöntemi mutlaka homojen bir örnek gerektirmez, ancak aşağıdaki projeksiyon eşleşen arıtma adım yüksek çözünürlük elde etmek için homojen bir numune gerekir.
Ol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar tam protokolleri kurmak için onların yardımına Yale Üniversitesi'nde ilk protokolleri ve Wang laboratuar kurmak yardımcı UC-Berkeley Nogales laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, verdikleri destek için Yale Tıp Okulu'nda cryo-EM tesis ve Yüksek Başarımlı Hesaplama Merkezi değnek kabul etmiş oluyorsunuz. HW Smith Aile Awardee.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Science | 63450-15-7 | ||
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Science | 22451 | ||
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientist | 4951F-001 | ||
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | ||
| Carbon coater Auto 306 | Edwards | |||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | |||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
References
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification – powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3′ end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
