Avslag på Fluorescens Bakgrund i resonans och spontana Raman microspectroscopy
Summary
Vi diskuterar byggande och drift av ett komplext ickelinjära optiska system som använder ultrasnabb heloptisk byter till isolera Raman från fluorescens signaler. Med detta system har vi möjlighet att lyckas skilja Raman och fluorescens signaler utnyttja puls energi och genomsnittlig krafter som finns kvar biologiskt säkra.
Abstract
Ramanspektroskopi är ofta plågas av en stark fluorescerande bakgrund, särskilt för biologiska prover. Om ett prov är glada med ett tåg av ultrasnabba pulser, ett system som tidsmässigt kan separera spektralt överlappande signaler på en pikosekund tid kan isolera snabbt ankommande Raman spritt ljus från sen ankomst fluorescens ljus. Här diskuterar vi byggande och drift av ett komplext ickelinjära optiska system som använder all-optisk koppling i form av en låg effekt optisk Kerr grind för att isolera Raman och fluorescens signaler. En enda 808 nm laser med 2,4 W i medeleffekt och 80 MHz repetitionsfrekvens är delad, med cirka 200 MW 808 nm ljus omvandlas till <5 MW 404 nm ljus som skickas till provet för att excitera Ramanspridning. Resterande oomvända 808 nm ljus skickas sedan till ett ickelinjärt medium där det fungerar som pumpen för alla optiska slutare. Slutaren öppnas och stängs i 800 FS med en maximal effektivitet på ca 5%. Med detta system har vi möjlighet att lyckas skilja Raman och fluorescens signaler på en 80 MHz repetitionsfrekvens med puls energi och genomsnittlig krafter som finns kvar biologiskt säkra. Eftersom systemet inte har någon ledig kapacitet i form av optisk effekt, vi detalj flera design och anpassning överväganden som stöd i att maximera genomströmningen av systemet. Vi diskuterar också våra protokoll för att erhålla den rumsliga och tidsmässiga överlappning av signalen och balkar pump inom Kerr medium, samt en detaljerad protokoll för spektrala förvärvet. Slutligen redovisar vi några representativa resultaten av Raman spektra som erhålls i närvaro av en stark fluorescens med hjälp av vår tid-slussning systemet.
Protocol
Discussion
Området biomedicinska Raman-spektroskopi har sett ökande intresse under de senaste åren som ett resultat av dess visat potential för att lösa flera svåra utmaningar i biologiska diagnostik. Till exempel har Raman spektra visat sig ha diagnostiskt värde i cancer upptäckt 3, 4, 5, 6. Raman-spektroskopi har också använts i bakterie kvantifiering 7, 8 och bakteriella läkemedel svar 9. Den har också funnit tillämpning i ett brett spektrum av andra biomedicinska tillämpningar som…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av NSF utmärkelse DBI 0.852.891. En del av detta arbete har också finansierats av Centrum för Biophotonics vetenskap och teknik, en utsedd NSF vetenskapligt och tekniskt centrum förvaltas av University of California, Davis, enligt samarbetsavtal Nej PHY0120999.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Lenses | ThorLabs | Various | All lenses coated to have maximum transmission losses of 1% each |
| Tunable Ti:Sapph laser | Coherent | Chameleon | 30 nJ, 200 fs, 80 MHz |
| 40X oil immersion objective | Olympus | UApo/340 | NA = 1.35 |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | Modified to remove all lenses in side port |
| Half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | |
| Glan-Thompson polarizer | Thorlabs | GTH10M | ˜10% transmission loss |
| Spectrometer | PI Acton | SP2300i | |
| CCD | PI Acton | Pixis 100B | |
| Mathmatical software | The MathWorks | MATLAB | version 2008a |
| Faraday isolator | EOT | BB8-5I | |
| Piezo-electric mirror | Newport | AG-M100 | |
| BBO crystal | CASIX | custom | 1 mm thickness |
| Bandpass filter 1 | Andover | 008FC14 | 808 ± 0.4 nm |
| Dichroic mirror | Semrock | FF662-FDI01 | band edge at 662 nm |
| Long-pass filter | Semrock | BLP01-405R | band edge at 417 nm |
| Bandpass filter 2 | Semrock | FF02-447/60 | 417-447 nm |
| CS2 | Sigma-Aldrich | 335266 | 99% purity |
| Coumarin 30 | Sigma-Aldrich | 546127 | 99% purity |
| Immersion oil | Cargille | 16242 | Type DF |
References
- Savitzky, A., Golay, M. J. E. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Analytical Chemistry. 36, 1627-1639 (1964).
- Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra. Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).
- Gniadecka, M. Melanoma diagnosis by Raman spectroscopy and neural networks: Structure alterations in proteins and lipids in intact cancer tissue. Journal of Investiga-tive Dermatology. 122, 443-449 (2004).
- Lieber, C. A., Majumder, S. K., Billheimer, D., Ellis, D. L., Mahadevan-Jansen, A. Raman microspectroscopy for skin cancer detection in vitro. Journal of Biomedical Optics. 13, 024013-024013 (2008).
- Chen, K., Qin, Y., Zheng, F., Sun, M., Shi, D. Diagnosis of colorectal cancer using Raman spectroscopy of laser-trapped single living epithelial cells. Optics Letters. 31, 2015-2017 (2006).
- Chan, J. W. Nondestructive identification of individual leukemia cells by laser trapping Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 80, 2180-2187 (2008).
- Zhu, Q. Y., Quivey, R. G., Berger, A. J. Measurement of bacterial concentration fractions in polymicrobial mixtures by Raman microspectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 9, 1182-1186 (2004).
- Rösch, P. Chemotaxonomic identification of single bacteria by micro-Raman spectroscopy: Application to clean-room-relevant biological contaminations. Applied and Environmental Microbiology. 71, 1626-1637 (2005).
- Moritz, T. J. Raman spectroscopic signatures of the metabolic states of escherichia coli cells and their dependence on antibiotics treatment. Biophysical Journal. 98, 742a-742a (2010).
- Dehring, K. A. Identifying chemical changes in subchondral bone taken from murine knee joints using Raman spectroscopy. Applied Spectroscopy. 60, 1134-1141 (2006).
- Berger, A. J., Koo, T. W., Itzkan, I., Horowitz, G., Feld, M. S. Multicomponent blood analysis by near-infrared Raman spectroscopy. Applied Optics. 38, 2916-2926 (1999).
- Qi, D., Berger, A. J. Chemical concentration measurement in blood serum and urine samples using liquid-core optical fiber Raman spectroscopy. Applied Spectroscopy. 46, 1726-1734 (2007).
- Beier, B. D., Berger, A. J. Method for automated background subtraction from Raman spectra containing known contaminants. The Analyst. 134, 1198-1202 (2009).
- De Luca, A. C., Mazilu, M., Riches, A., Herrington, C. S., Dholakia, K. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 82, 738-745 (2010).
- Evans, C. L. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 16807-16812 (2005).
- Jones, W. J., Stoiche, . Inverse raman spectra: Induced absorption at optical frequencies. Physical Review Letters. 13, 657-659 (1964).
- Freudiger, . Label-Free et Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Cui, M., Bachler, B. R., Ogilvie, J. P. Comparing coherent and spontaneous Raman scattering under biological imaging conditions. Optics Letters. 34, 773-775 (2009).
- Matousek, P., Towrie, M., Stanley, A., Parker, A. W. Efficient rejection of fluorescence from Raman spectra using picosecond Kerr gating. Applied Spectroscopy. 53, 1485-1489 (1999).
- Matousek, P. Fluorescence suppression in resonance Raman spectroscopy using a high-performance picosecond Kerr gate. Journal of Raman Spectroscopy. 32, 983-988 (2001).
- Knorr, F., Smith, Z. J., Wachsmann-Hogiu, S. Development of a time-gated system for Raman spectroscopy of biological samples. Optics Express. 18, 20049-20058 (2010).
