我们描述了一个协议,允许在较长的时间,通过荧光显微镜观察生活中的神经元线粒体成像。过长时间的成像是通过一个mitochondrially有针对性的荧光蛋白,并利用一种廉价的舞台上方的孵化器,在我们的实验室设计和内置的慢病毒介导的表达。
要了解线粒体运输和神经功能之间的关系,关键是观察 1-3延长工期的生活培养的神经元线粒体的行为。这是现在可以通过使用重要的染料和荧光蛋白与细胞骨架,细胞器,并在活细胞中的其他结构可以被标记,然后通过动态的荧光显微镜,可视化。例如,在鸡胚交感神经元,线粒体运动的特点,使用的重要染料罗丹明123 4 。在另一项研究中,线粒体mitochondrially针对性EYFP 5转染大鼠前脑神经元的可视化。然而,初级神经元,超过分钟,小时,甚至天的成像提出了一些问题。其中最重要的是:1)维护的培养条件,如温度,湿度,pH值在长成像会话; 2)一个强大,稳定的荧光信号,以确保获得的图像质量和信号强度的精确测量,在图像分析; 3)限制在图像采集的曝光时间,以尽量减少漂白,避免光毒性。
在这里,我们描述了一个协议,允许观察,可视化和高时间分辨率和最佳的生活支持条件下培养的海马神经元线粒体运动分析。我们已经构建了一个负担得起的阶段顶孵化器提供了良好的温度调节和大气中的气体流量,也限制了媒体蒸发的程度,以确保稳定的pH值和渗透压。这个孵化器连接,通过进口和出口软管,一个标准的组织培养孵化器,它提供恒定的湿度水平和 5-10%的CO 2 /空气气氛。这种设计提供了一个成本效益的替代昂贵得多显微镜孵化器不一定保证了许多数小时甚至数天的细胞活力。为了形象化线粒体,我们与编码,有针对性地线粒体红色荧光蛋白的慢病毒感染的细胞。这保证了强大的和持久的的信号,配合稳定的氙气光源的使用,使我们能够限制在图像采集的曝光时间,但排除漂白和光毒性。舞台上方的孵化器顶部的两个注射口允许的神经递质和其他试剂的急性政府调节线粒体运动。总之,表达慢病毒介导的细胞器有针对性的红色荧光蛋白和我们的舞台上方的孵化器,传统的倒置荧光显微镜,CCD摄像头,以及氙气光源的结合使我们能够获得线粒体运输时间推移图像生活过较长的持续时间可能比那些在研究部署常规重要的染料和关闭的,现成的生命支持系统的神经元。
采用有针对性地在感染培养的神经元线粒体荧光蛋白的慢病毒介导的表达和廉价的实验室建阶段顶的孵化器,允许延长工期的活细胞成像,我们已经能够进行调查线粒体运动和neuromodulatory信号之间的联系5 – 羟色胺(5 – HT),多巴胺(DA),乙酰胆碱(ACH)等。我们的研究有助于阐明信号通路,第一次,链接线粒体贩运活动的神经递质,如5 – HT和DA神经元调制的变化 – 心脏神经功能。我们发现,使用有针对性的荧光蛋白许可证标记长时间,可能会比更短的工期可以使用重要的染料有关的生理,生活培养的神经元的线粒体观察。此外,荧光蛋白信号的强度,使我们能够保持在图像采集的曝光时间短,最大限度地减少漂白或光毒性的可能性。最后,一个简单和廉价的阶段顶部的孵化器,保持环境的温度,湿度,和二氧化碳水平,同时尽量减少媒体的蒸发,使我们能够按照居住超过几小时甚至几天的神经细胞线粒体运动。想编造一个阶段顶部的“孵化器”在活的神经元线粒体的长期观测的研究人员需要按照我们的设计提供精确的细节,使用(例如,透氧膜,以避免媒体蒸发的材料特性)和应用(例如,温度和湿度控制,pH值,渗透压维护的缓冲)的原则一般是在本议定书中所描述的一致。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢他在舞台上方的孵化器的设计和制造技术的专业知识和高超的技巧贡献唐纳德赫特森。我们也感谢Ayda Dashtaei为她出色的技术援助。所有的工作是研究基金会的神经科学的支持。
Quantity | Description (and Location in Figure 1) |
---|---|
1 | Tissue culture incubator (H) |
1 | Heat-resistant plastic enclosure (delrin or comparable) (A) |
1 | Plastic frame for 35mm GBM lid (for affixing membrane to petri dish) (M) |
1-2 | linear ft. Clear PFTE (Teflon) membrane material |
4 | Brass thumb screws |
2 | Small 10kOhm heatsink resistors (used as heating elements inside stage-top incubator enclosure) |
1 | Transformer (supply of 9V current to resistors) |
1 | Terrarium temperature controller and probe (thermostatic regulation of power to heatsink resistors via transformer) |
1 | 2000ml Erlenmeyer flask (muffler for vibration suppression in hose before stage-top incubator) (K) |
1 | 1/8″ sorbothane sheet (gasket material for base of stage-top incubator) |
1 | Airtight ABS (or comparable) plastic box (housing for aquarium pump) (J) |
1 | Aquarium pump (I) |
1 | Small computer cooling fan |
1 | Plastic enclosure for cooling fan (L) |
1 | 9V transformer for computer cooling fan |
20-30ft | Nalgene or silicone hose (connections between tissue culture and stage-top incubators; moisture traps) (F,G,N) |
2 | Plastic stopcocks (to open and close air flow before and after stage-top incubator) (O) |
4 | Barbed brass hose connectors (for hose connections to/from stage-top incubator and aquarium pump enclosure) |
2 | Brass quick couplers (for hose connections to/from stage-top incubator) |
2 | Brass quick couplers (for hose connections to/from stage-top incubator) |
Table 1. Stage-top incubator parts:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG |
laminin | Roche Applied Science | 11243217001 |
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-0-14-C |
DMEM | Life Technologies | 10567 |
B27 | Life Technologies | 17504-044 |
Glutamax | Life Technologies | 35050 |
Lipid-rich BSA | Life Technologies | 11020-021 |
L-Asparagine | Sigma-Aldrich | P0380-100G |
L-Proline | Sigma-Aldrich | A8381-100G |
Vitamin B-12 | Sigma-Aldrich | V2876-100MG |
5-HT | Sigma-Aldrich | H9523-25MG |
8-OH-DPAT | Sigma-Aldrich | H8520-25MG |
Dopamine | Sigma-Aldrich | H8502-5G |
Bromocriptine | Sigma-Aldrich | B2134-25MG |
SKF38393 | Sigma-Aldrich | D047-100MG |