我々は、長時間にわたって蛍光顕微鏡を介して神経細胞を生体内でミトコンドリアのイメージングを可能にするプロトコルを記述する。長期間にわたるイメージングは、我々の研究室で設計し、構築されたミトコンドリア標的蛍光蛋白質と安価なステージトップインキュベーターの使用のレンチウイルスを介した発現を介して実行されます。
ミトコンドリア輸送と神経機能の関係を理解するために、それは1-3拡張された期間のためのライブ培養神経細胞におけるミトコンドリアの挙動を観察することが重要です。これは生きている細胞の細胞骨格成分、細胞小器官、および他の構造を標識することができるとの重要な染料と蛍光タンパク質を使用することで可能になりましたし、動的な蛍光顕微鏡を介して可視化した。例えば、胚性ニワトリ交感神経ニューロンにおいて、ミトコンドリアの動きは生体染色色素のローダミン123 4を用いて特徴付けられた。別の研究で、ミトコンドリアはミトコンドリア標的EYFP 5のトランスフェクションにより、ラットの前脳の神経細胞で可視化した。しかし、一次分以上のニューロン、時間、または数日間の撮影は、多くの問題を提示。何よりもこれらの間にある:1)そのような温度、湿度、および長時間の撮像セッション中に、pHなどの培養条件の維持、画像解析時に信号強度の取得画像の品質と正確な測定の両方を確保するため2)強い、安定した蛍光シグナル;および3)退色最小限に抑え、光毒性を避けるために、画像取得時の露光時間を制限する。
ここでは、観察、可視化、および高時間分解能で、最適な生命維持の条件下で培養海馬神経細胞におけるミトコンドリアの動きの分析を可能にするプロトコルを記述する。我々は、良好な温度調節と雰囲気ガスの流れを提供する手頃なステージトップインキュベーターを建設し、また安定したpHと浸透圧を確保し、メディアの蒸発の程度を制限している。このインキュベータは、一定の湿度レベルを提供する標準組織培養インキュベーター、5〜10%のCO 2 /空気の雰囲気に、入口、出口ホースを経由して、接続されている。この設計は、必ずしも多くの時間あるいは数日にわたって細胞の生存を保証していないはるかに高価な顕微鏡のインキュベーターに代わるコスト効率を提供しています。ミトコンドリア可視化するために、我々は、ミトコンドリアを対象としている赤色蛍光蛋白質をコードするレンチウイルスで細胞を感染させる。これは安定キセノン光源の使用と併せて、私たちは画像取得時の露光時間を制限することを可能にし、すべてが光退色と光毒性排除する、強力かつ持続的な信号を、保証します。ステージトップインキュベーターの上部にある2つの注入ポートは、意図した神経伝達物質や他の試薬の急性投与は、ミトコンドリアの動きを調節することができます。オルガネラを標的と赤色蛍光タンパク質と私たちのステージトップインキュベーター、従来の倒立蛍光顕微鏡、CCDカメラ、およびキセノン光源の組み合わせの和、レンチウイルスを介した表現で私たちがでミトコンドリア輸送のタイムラプス画像を取得することができます従来の重要な染料と既製の生命維持システムを導入する研究の可能性よりも長い期間にわたって生きているニューロン。
レンチウイルスを介した感染培養神経細胞のミトコンドリアをターゲットと蛍光タンパク質の発現と延長期間のための生細胞のイメージングを可能にする安価なラボ構築ステージトップインキュベーターを採用し、我々は、ミトコンドリアの動きと神経調節の信号間のリンクを調査することができた、セロトニン(5 – HT)、ドーパミン(DA)、及びアセチルコリン(ACH)など。神経機能の心臓部である – 私たちの研究は、その、初めて、リンクなどの5 – HTとDAのような神経伝達物質によって変調されたニューロンの活動の変化にミトコンドリアの人身売買シグナル伝達経路を解明するために役立っています。我々は、標的蛍光タンパク質の使用は、より多くの生理学的に関連する重要な染料を使用して可能なはるかに短い期間よりも可能性が長期間にわたって培養神経細胞を生体内でミトコンドリアというラベルの観察を可能にすることがわかります。さらに、蛍光タンパク質のシグナルの強度は、光退色や光毒性の可能性を最小限に抑え、私たちは画像取得時の露光時間を短くすることができます。最後に、シンプルで安価なステージトップインキュベーターメディアの蒸発を最小限に抑えながら、周囲温度、湿度、およびCO 2のレベルを維持し、私たちはさらに数時間または数日にわたってニューロンを生体内でミトコンドリアの動きをたどることができます。ライブニューロンのミトコンドリアの長期的な観測のためにステージトップインキュベーターを作製する研究者が使用する材料の特性(例えば、ガス透過性膜媒体の蒸発を避けるために提供されて、私たちのデザインの正確な詳細に従う必要はありません)と(例えば、温度、湿度コントロール、浸透圧のpHは、メンテナンスのバッファリング)適用される原則は、一般的にこのプロトコールに記載されているものと一致している。
The authors have nothing to disclose.
我々は、ステージ上インキュベーターの設計と製造の間に彼の技術的な専門知識と優れた技術を貢献するためにドナルドハットソンに感謝します。私たちは、彼女の優秀な技術支援のためにもAyda Dashtaeiに感謝しています。すべての作業は、神経科学研究財団によってサポートされていました。
Quantity | Description (and Location in Figure 1) |
---|---|
1 | Tissue culture incubator (H) |
1 | Heat-resistant plastic enclosure (delrin or comparable) (A) |
1 | Plastic frame for 35mm GBM lid (for affixing membrane to petri dish) (M) |
1-2 | linear ft. Clear PFTE (Teflon) membrane material |
4 | Brass thumb screws |
2 | Small 10kOhm heatsink resistors (used as heating elements inside stage-top incubator enclosure) |
1 | Transformer (supply of 9V current to resistors) |
1 | Terrarium temperature controller and probe (thermostatic regulation of power to heatsink resistors via transformer) |
1 | 2000ml Erlenmeyer flask (muffler for vibration suppression in hose before stage-top incubator) (K) |
1 | 1/8″ sorbothane sheet (gasket material for base of stage-top incubator) |
1 | Airtight ABS (or comparable) plastic box (housing for aquarium pump) (J) |
1 | Aquarium pump (I) |
1 | Small computer cooling fan |
1 | Plastic enclosure for cooling fan (L) |
1 | 9V transformer for computer cooling fan |
20-30ft | Nalgene or silicone hose (connections between tissue culture and stage-top incubators; moisture traps) (F,G,N) |
2 | Plastic stopcocks (to open and close air flow before and after stage-top incubator) (O) |
4 | Barbed brass hose connectors (for hose connections to/from stage-top incubator and aquarium pump enclosure) |
2 | Brass quick couplers (for hose connections to/from stage-top incubator) |
2 | Brass quick couplers (for hose connections to/from stage-top incubator) |
Table 1. Stage-top incubator parts:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG |
laminin | Roche Applied Science | 11243217001 |
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-0-14-C |
DMEM | Life Technologies | 10567 |
B27 | Life Technologies | 17504-044 |
Glutamax | Life Technologies | 35050 |
Lipid-rich BSA | Life Technologies | 11020-021 |
L-Asparagine | Sigma-Aldrich | P0380-100G |
L-Proline | Sigma-Aldrich | A8381-100G |
Vitamin B-12 | Sigma-Aldrich | V2876-100MG |
5-HT | Sigma-Aldrich | H9523-25MG |
8-OH-DPAT | Sigma-Aldrich | H8520-25MG |
Dopamine | Sigma-Aldrich | H8502-5G |
Bromocriptine | Sigma-Aldrich | B2134-25MG |
SKF38393 | Sigma-Aldrich | D047-100MG |