Hela Cell Spela in från en Organotypic Slice Beredning av neocortex
Summary
Detta är ett protokoll för att förbereda och upprätthålla en hjärnbarkens skiva beredning i organotypic kulturen för att göra elektriska inspelningar från pyramidala nervceller.
Abstract
Vi har studerat uttrycket och funktionella roller spänningskänsliga kaliumkanaler i pyramidala neuron från råtta neocortex. På grund av bristen på specifika farmakologiska medel för dessa kanaler har vi tagit en genetisk strategi för att manipulera kanal uttryck. Vi använder en organotypic kultur förberedelse (16) för att upprätthålla cellmorfologin och laminära mönster av cortex. Vi isolerar vanligtvis akut hjärnbarkens skivor på postnatal dagar 8-10 och underhålla skivor i kultur för 3-7 dagar. Detta ger oss möjlighet att studera nervceller vid samma ålder med dem i vårt arbete med akut skivor och minimerar utvecklingen av översvallande excitatoriska anslutningar i segmentet. Vi spela in från visuellt identifierade pyramidformade nervceller i lager II / III eller V med hjälp av IR-belysning (IR-) och differential interferens kontrast mikroskopi (DIC) med hela cell patch clamp i ström-eller spännings-klämma. Vi använder biolistic (Gene pistol) transfektion av vildtyp eller mutant kaliumkanal DNA att manipulera uttrycket för kanalerna för att studera deras funktion. De transfekterade cellerna är lätt identifieras av epifluorescence mikroskopi efter samtidigt transfektion med cDNA för grönt fluorescerande protein (GFP). Vi jämför inspelningar av transfekterade celler till angränsande, untransfected nervceller i samma lager från samma skiva.
Protocol
Discussion
Vi har studerat uttrycket och funktionella roller spänningskänsliga kaliumkanaler i pyramidala neuron från råtta neocortex (4, 9-11). På grund av bristen på specifika farmakologiska medel för dessa kanaler, använder vi en genetisk metod för att manipulera kanal uttryck (1,14,15,17-19). Vi använder en organotypic kultur förberedelse (2,3, 5-8, 12,13,15-22). Ändras från den strategi Stoppini et al (16), i syfte att upprätthålla cellmorfologin och laminära mönster av cortex. Vi isolerar a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Mayumi Sakuraba och Rebecca Foehring för enastående tekniskt bistånd. Dessutom vill vi tacka Dr. Rodrigo Andrade för att få hjälp med att genomföra organotypic slice kultur och biolistic protokoll transfektion och Dr Jeanne Nerbonne för att förse oss med cDNA konstruktioner för transfektion. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag: NS044163 från NINDS (för RCF).
Materials
Surgery / transfection / culture:
- Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
- Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
- Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
- Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
- disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
- 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
- Tefzel Tubing: #165-2441
- Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984- 3766).
Media:
- Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
- HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
- Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
- 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.
Recording:
- Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
- Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
- Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- lectrode position is controlled with Sutter ROE-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
- Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
- IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).
References
- Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
- Buonomano, D. V. Timing of neural responses in cortical organotypic slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).
- Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex. Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).
- Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons. Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
- Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue. Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).
- Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones. J Physiol. 571, 371-389 (2006).
- Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).
- Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons. J Physiol. 581, 941-960 (2007).
- Johnson, H. A., Buonomano, D. V. A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes. Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).
- Johnson, H. A., Buonomano, D. V. Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices. J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).
- Malin, S. A., Nerbonne, J. M. Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).
- O’Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons. J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).
- Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons. J Neurochem. 75, 882-885 (2000).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- O’Brien, J. A., Lummis, S. C. Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun. Nat Proc. 1, 977-981 (2006).
- Joshi, P., Dunaevsky, A. Gene gun transfection of hippocampal neurons. J Vis Exp. , (2006).
- Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. . J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).
