Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma
Summary
Floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile rafine bir hücre disosiasyon protokolü birleştirir fare testis yüksek derecede saflaştırılmış yaşayabilir mayotik kesirler elde etmek için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, DNA içeriği ve ayrık mayotik kesirler nükleer yoğunluğu farklılıkları yararlanır.
Abstract
Testis hücre tipleri heterojen doğası ve mayoz hücre kültürü modelleri yokluğunda mayoz bölünme sırasında ortaya eşsiz bir farklılaşma programları çalışma için önemli engellerin edilmiştir. BSA ve / veya Percoll gradyanlar Yıkayarak tasviye veya Staput (sedimantasyon): İki ana yöntemleri, değişen derecelerde, hem yetişkin ve immatür hayvanlarda çeşitli mayotik kesirler arındırmak için geliştirilmiştir var. Bu yöntemlerin her ikisi mayotik hücreleri 1-5 ayrı hücre boyutu ve yoğunluğu güveniyor. Genel olarak, birkaç hücre popülasyonlarının 6 dışında, bu protokolleri detaylı moleküler analizler için gerekli olan çok sayıda mayotik hücre popülasyonlarının yeterli saflıkta verim başarısız olur. Ayrıca, bu tür yöntemleri ile genellikle tek tip mayotik hücreleri mayoz hücre örnekleri karşılaştırarak tekrarlanabilirlik ve homojenlik ile ilgili ekstra bir karmaşıklık düzeyi ekler belirli bir zaman, arındırılmalıdır.
Burada, Hoechst 33.342 boyama 7,8 ile birlikte FACS kullanarak, germ hücreleri, yuvarlak spermatid, zarif bir yöntem tarif biri kolayca görselleştirmek belirlemek ve mayotik hücreleri arındırmak sağlar . Bu yöntem tüm mayotik sürecinin genel bir anlık sağlar ve bir mayoz en aşamasından son derece canlı hücreler arındırmak için izin verir. Bu saflaştırılmış hücreler daha sonra 11 mayotik rekombinasyon noktalarından örnek gen ekspresyonu 9,10 değişiklikleri ve nucleosome doluluk dinamikleri, mayoz bölünme yoluyla ilerlemesi eşlik moleküler değişiklikler için ayrıntılı olarak analiz edilebilir.
Protocol
Discussion
Burada sunulan protokol biri eş zamanlı olarak araştırmacılar, bu temel sürecin dinamiklerini incelemek için izin yetişkin erkek fareler, çok yüksek saflıkta mayotik sahne hücrelerinin tüm aralığı arındırmak için izin verir. Saf hücrelerin RNA ekstraksiyon 9,10, nucleosome haritalama 11, rekombinant molekül algılama, protein analizi, ve daha birçok arasında değişen çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Ancak, algılama yöntemleri, saflaştırılmış mayotik h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje, Florida Devlet Scripps ve ödül sayıları sırasıyla Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü R01GM085079 ve R21HD061304 paralar kısmen desteklenmiştir. Bu Scripps Araştırma Enstitüsü yazının sayısı 20.917.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
| Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
| Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
| 6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
