الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

Summary

تجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح لتقييم الخصائص الكثيرة مباشرة من اثنين من السكان مختلفة من الخلايا في ماوس واحدة. نحن هنا لتوضيح هذا الإجراء من خلال مقارنة الهجرة من خارج الحي ولدت مدار – الأمعاء مقابل عدم الأمعاء مدار الخلايا التائية.

Abstract

من أجل ممارسة وظيفتها اللمفاويات الحاجة إلى مغادرة الدم وتهاجر إلى الأنسجة المختلفة في الجسم. التصاق الخلايا اللمفاوية لخلايا بطانة الأوعية الدموية والأنسجة التسرب هو عملية متعددة الخطوات التي تسيطر عليها التصاق جزيئات مختلفة (صاروخ موجه المستقبلات) في الخلايا الليمفاوية وأعرب كل منهما يغاندس (addressins) المعروضة على الخلايا البطانية ^{1 2.} على الرغم من يمكن أن تكون وظيفة هذه المستقبلات التصاق درس جزئيا خارج الحي ، والاختبار النهائي لأهميتها الفسيولوجية هو تقييم دورها في خلال التصاق الخلايا اللمفاوية فيفو والهجرة. وقد استخدمت استراتيجيتين تكميلية لهذا الغرض : intravital المجهري (IVM) ، وتجارب صاروخ موجه. على الرغم من IVM كانت ضرورية لتحديد دقيق للمساهمة مستقبلات الالتصاق محددة خلال تتالي التصاق في الوقت الحقيقي والأنسجة المختلفة ، IVM تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة ، فإنه غالبا ما يتطلب تطوير تقنيات جراحية متطورة ، فإنها بحاجة إلى العزلة من قبل متجانسة السكان الخلية ويسمح تحليل واحد فقط الجهاز / الأنسجة في أي وقت من الأوقات. على النقيض من ذلك ، والتجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح المقارنة المباشرة والفورية في الهجرة من اثنين (أو أكثر) مجموعات فرعية خلية في الماوس نفسه ، وأنها تسمح أيضا تحليل العديد من الأنسجة وعدد كبير من الخلايا في التجربة نفسها.

نحن هنا وصف الكلاسيكية بروتوكول صاروخ موجه تنافسية استخدمت لتحديد ميزة / الحرمان من نوع الخلية بالنظر إلى المنزل لأنسجة معينة بالمقارنة مع التحكم في عدد السكان الخلية. اخترنا لتوضيح خصائص المهاجرة مدار – الأمعاء الأمعاء ، مقابل عدم مدار الخلايا التائية ، وذلك لأن الغشاء المخاطي المعوي هو السطح أكبر هيئة في اتصال مع البيئة الخارجية وأنه هو أيضا من خارج النسيج اللمفاوي أفضل مع متطلبات محددة المهاجرة . وعلاوة على ذلك ، فقد قرر العمل مؤخرا بأن فيتامين (أ) المستقلب جميع العابر حمض الريتينويك (RA) هي الآلية الرئيسية الجزيئية المسؤولة عن التصاق الأمعاء تحريض مستقبلات محددة (إنتغرين مستقبلات chemokine a4b7and CCR9) في الخلايا الليمفاوية. وبالتالي ، فإننا قادرون على توليد بسهولة أعداد كبيرة من فيفو السابقين الأمعاء ، وغير مدار الأمعاء ، عن طريق تنشيط الخلايا الليمفاوية مدار خلايا تي في وجود أو عدم وجود التهاب المفاصل الروماتويدي ، على التوالي ، والتي يمكن استخدامها أخيرا في التجارب صاروخ موجه التنافسية الموصوفة هنا.

Protocol

1. فيفو الجيل السابق من الخلايا T – هومينغ الأمعاء والسيطرة (انظر الشكل 1) عزل splenocytes بواسطة يهرس one الطحال نوع من الفئران البرية. Resuspend تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 "في غرام × 400 …

Discussion

على الرغم من التجارب صاروخ موجه تقديم معلومات قيمة للغاية حول هجرة السكان الكلي في أي خلية نسيج معين ، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن هذه المقايسات لا نحلل مباشرة الالتصاق البطانية وبالتالي فهي لا تميز فيها الخطوة (ق) من الالتصاق متعددة الخطوات شلال (الربط / المتداول ، أ…

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercaptoethanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO₃, 150 mM NH₄Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca⁺⁺ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin – IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).