מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell
Summary
ניסויים ביות תחרותי לאפשר ישירות להעריך את מאפייני הנדידה של שתי אוכלוסיות תאים שונות עכבר אחת. כאן אנו מדגימים הליך זה על ידי השוואת ההגירה לשעבר טרופי-vivo הבטן שנוצר לעומת אי – טי בטן תאים טרופי.
Abstract
על מנת להפעיל לימפוציטים תפקידם צריכים לעזוב את הדם ולנדוד לרקמות שונות בגוף. הידבקות הלימפוציטים לתאי האנדותל extravasation רקמות הוא תהליך רב שלבי נשלט על ידי מולקולות הדבקה שונות (קולטנים ביות) הביע על לימפוציטים ו ligands שלהם (addressins) מוצג לתאי אנדותל 1 2. אף על פי פונקציה של קולטנים אלה הדבקה ניתן ללמוד באופן חלקי לשעבר vivo, את המבחן האולטימטיבי רלוונטיות פיזיולוגיים שלהם הוא להעריך את תפקידם במהלך הידבקות ב לימפוציטים הגירה vivo ו. שתי אסטרטגיות משלימות שימשו למטרה זו: מיקרוסקופיה intravital (IVM) וניסויים ביות. למרות IVM כבר חיוני להגדיר את התרומה המדויקת של הידבקות קולטנים ספציפיים במהלך מפל הידבקות בזמן אמת ברקמות שונות, IVM היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית, לעתים קרובות מחייב פיתוח של שיטות ניתוח מתוחכם, הוא צריך בידוד מראש של הומוגנית אוכלוסיות תאים וזה מאפשר ניתוח של איבר אחד בלבד רקמה / בכל זמן נתון. לעומת זאת, ניסויים ביות תחרותי לאפשר השוואה ישירה סימולטני הגירה של שני (או אפילו יותר) תת תא העכבר אותו והם גם היתר ניתוח של רקמות רבות של מספר גבוה של תאים בניסוי זהה.
כאן אנו מתארים את פרוטוקול קלאסית ביות תחרותי בשימוש כדי לקבוע את היתרון / חיסרון של סוג תא נתון לבית לרקמות ספציפיות לעומת האוכלוסייה תא שליטה. בחרנו להדגים את מאפייני הנדידה של טרופי בטן לעומת הלא קרביים טרופי בתאי T, כי רירית המעי הוא משטח הגוף הגדול ביותר במגע עם הסביבה החיצונית, והיא גם רקמת הלימפה במיוחד עם מיטב מוגדרים דרישות הנדידה . יתר על כן, העבודה האחרונה קבעה כי הוויטמין חומצה המטבוליט כל טרנס retinoic (ע"ר) הוא המנגנון המולקולרי האחראי העיקרי גרימת בטן ספציפי קולטנים הידבקות (integrin קולטן a4b7and chemokine CCR9) על לימפוציטים. לפיכך, אנו יכולים בקלות ליצור מספר רב של vivo לשעבר מעיים טרופי ולא מעיים טרופי ידי הפעלת לימפוציטים ותאי T בנוכחות או היעדרו של RA, בהתאמה, אשר ניתן להשתמש בהם בסופו של דבר בניסויים ביות תחרותי המתואר כאן.
Protocol
Discussion
למרות ניסויים ביות לספק מידע בעל ערך רב על הגירה של אוכלוסיות תאים ברקמות סך נתון, יש לזכור כי מבחני אלו אינן ישירות לנתח הידבקות האנדותל, ולכן לא להפלות שבו צעד (ים) של הידבקות רב שלבי אשד (קשירה / מתגלגל, הפעלה או דבק) קולטן ביות נתון פועל. תקן הזהב להגדיר את התפקיד הספצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EJV נתמך על ידי מענק מן ה-S & קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה (CCFA). JRM הוא נתמך על ידי מענקים CCFA, Cancer Research Institute (CRI), הווארד ח גודמן (MGH), מסצ'וסטס Life Science Center (MLSC) ואת פרס ממציא ניו NIH של המנהל.
Materials
Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).
Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercaptoethanol.
ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).
PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).
Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.
T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.
Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.
Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin – IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).
All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).
References
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Iwata, M. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21, 527-538 (2004).
- Mora, J. R. Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues. J Exp Med. 201, 303-316 (2005).
- Mora, J. R. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424, 88-93 (2003).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
