腸管指向性T細胞の移動を研究するために競争力のあるホーミングアッセイ
Summary
競争力のあるホーミングの実験は、直接、単一のマウスの2つの異なる細胞集団の遊走特性を評価することができます。ここでは、生体外で生成された腸管指向性と非腸熱帯T細胞の遊走を比較することによって、この手順を示しています。
Abstract
それらの機能リンパ球を発揮するために血液を離れて、体内の異なる組織に移行する必要があります。内皮細胞と組織の溢出にリンパ球の接着は、リンパ球と内皮細胞1 2上に表示されるそれぞれのリガンド（アドレシン）に発現する別の接着分子によって制御される多段階プロセス（ホーミング受容体）である。これらの接着受容体の機能が部分的にex vivoで検討することができるにもかかわらず、それらの生理的関連性の究極のテストは、 生体内リンパ球の接着および遊走の中に自分の役割を評価することである。生体顕微鏡（IVM）とホーミングの実験：二つの補完的な戦略は、この目的のために使用されています。 IVMは、リアルタイムで、異なる組織の接着カスケード時に特定の接着受容体の正確な寄与を定義するために必要不可欠なってきていますが、IVMは時間がかかり、労働集約的であり、それはしばしば、高度な手術手技の開発を必要とする、それは均質の前の分離が必要細胞集団と、それは任意の時点で唯一の組織/臓器の分析を可能にします。これとは対照的に、競争力のあるホーミングの実験では、同じマウスの2つ（あるいはそれ以上）細胞サブセットの移行における直接的と同時比較が可能となり、彼らはまた、多くの組織のと同じ実験中の細胞の数が多いの分析を可能にする。
ここでは、コントロール細胞集団と比較して、特定の組織へホームへ所定の細胞型の利点/欠点を決定するために使用される古典的な競争力のあるホーミングプロトコルについて説明します。腸の粘膜が外部環境と接触する最大の身体の表面であり、それはまた最高の定義の渡り鳥要件を持つ追加のリンパ組織であるので、我々は、腸管指向性に対する腸管指向性以外のT細胞の遊走特性を説明するために選んだ。また、最近の研究では、ビタミンが代謝オールトランスレチノイン酸（RA）がリンパ球上に腸に特異的な接着受容体（インテグリンa4b7andのケモカイン受容体CCR9）を誘導に関与する主要分子機構であると判断しました。従って、我々は容易にようやくここで説明する競争力のあるホーミングの実験で使用することができる、それぞれ、RAの存在下または非存在下でT細胞を活性化することによって腸指向性とリンパ球腸管指向性非ex vivoでの多数を生成することができます。
Protocol
Discussion
ホーミングの実験は、任意の組織の全細胞集団の移行についての非常に貴重な情報を提供していても、それはこれらのアッセイは、直接血管内皮の接着性を分析していないため、多段階の接着性の中のステップ（複数可）を区別しないことを心に留めておく必要がありますカスケード（ローリング/テザリング、活性化または付着）所定のホーミング受容体が機能しています。接着カスケード…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EJVは、アメリカのクローン病S＆大腸炎財団（CCFA）のフェローシップでサポートされています。 JRMはCCFA、がん研究所（CRI）、ハワードH.グッドマン（MGH）、マサチューセッツ州ライフサイエンスセンター（MLSC）とNIHのディレクターの新イノベーター賞からの補助金によってサポートされています。
Materials
Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).
Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercaptoethanol.
ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).
PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).
Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.
T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.
Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.
Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin – IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).
All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).
References
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