Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T

Summary

Competitiva homing experimentos permitem avaliar diretamente as propriedades migratória de duas populações celulares diferentes em um único rato. Aqui nós ilustrar este procedimento através da comparação da migração de ex-vivo gerado gut trópico-versus non-gut células T trópico.

Abstract

A fim de exercer sua função linfócitos necessidade de deixar o sangue e migram para diferentes tecidos no organismo. Adesão dos linfócitos às células endoteliais e extravasamento de tecido é um processo de várias etapas controladas por diferentes moléculas de adesão (receptores homing) expressa em linfócitos e seus ligantes respectivos (addressins) exibidos em células endoteliais ^{1 2.} Mesmo que a função desses receptores de adesão pode ser parcialmente estudou ex vivo, o teste final para sua relevância fisiológica é avaliar o seu papel durante na adesão de linfócitos vivo e migração. Duas estratégias complementares têm sido utilizados para esse fim: microscopia intravital (IVM) e experimentos homing. Embora IVM tem sido essencial para definir a contribuição precisa de receptores de adesão específicos durante a cascata de adesão em tempo real e em diferentes tecidos, IVM é demorado e trabalhoso, que muitas vezes requer o desenvolvimento de sofisticadas técnicas cirúrgicas, que necessita de isolamento antes de homogêneo populações de células e permite a análise de apenas um órgão, tecido / a qualquer momento. Pelo contrário, competitiva experimentos homing permitir a comparação direta e simultânea na migração de duas (ou mais) em subpopulações de células com o mouse mesmo e eles também permitem a análise de muitos tecidos e de um elevado número de células no mesmo experimento.

Aqui nós descrevemos o protocolo competitivo clássica homing usado para determinar a vantagem / desvantagem de um tipo de célula dado a casa para tecidos específicos, em comparação com uma população de células controle. Escolhemos para ilustrar as propriedades migratórias do intestino trópico-versus células não gut trópico-T, porque a mucosa intestinal é a superfície maior corpo em contato com o ambiente externo e também é o tecido extra-linfóides com os requisitos definidos pelo melhor migratórias . Além disso, trabalhos recentes determinou que a vitamina A, ácido all-trans retinóico metabólito (RA) é o principal mecanismo molecular responsável pela indução de receptores específicos gut-adesão (integrinas receptor de quimiocina a4b7and CCR9) em linfócitos. Assim, podemos facilmente gerar um grande número de gut-tropical e não gut trópico de linfócitos ex vivo pela ativação de células T na presença ou ausência de RA, respectivamente, o que pode ser finalmente utilizado nos experimentos competitivos homing descrito aqui.

Protocol

1. Geração ex vivo de células T gut-homing e controle (ver Figura 1) Isolar esplenócitos por mashing um baço de camundongos de tipo selvagem. Volte a suspender as células em suspensão PBS e centrifugar por 5 'a 400 x g. Remover o sobrenadante e lise das células vermelhas do sangue pela ressuspensão do pellet celular em 4 ml de tampão de lise ACK por 2-3 minutos. Depois disso, adicione 5 ml de PBS. Centrifugar por 5 'a 400 xg e remover o sobrenadante. Ressuspender esplenóc…

Discussion

Apesar de experimentos homing fornecer informações valiosas sobre a migração de populações de células totais em qualquer dado tecido, ele deve ser mantido em mente que estes ensaios não analisam diretamente adesão endotelial e, portanto, não discriminar em qual etapa (s) da adesão de várias etapas cascata (tethering / rolamento, ativação ou furar) um determinado receptor homing está agindo. O padrão ouro para definir o papel específico dos receptores de homing na cascata de adesão é de microscopia int…

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercaptoethanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO₃, 150 mM NH₄Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca⁺⁺ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin – IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).