Twee-foton beeldvorming heeft blootgelegd lymfocyten beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en gedurende een immuunrespons 1. Hier laten we zien adoptieve overdracht van T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de geëxplanteerd lymfeklier.
Twee-foton beeldvorming is gebleken dat een elegante choreografie van beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en aan het begin van een immuunrespons 1. Hier presenteren we methoden voor adoptieve overdracht van gelabelde T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de lymfeklier geëxplanteerd zoals eerst beschreven in 2002 2. Twee-foton beeldvorming van immuuncellen vereist dat de cellen fluorescent zijn gelabeld, hetzij door kleuring met een cel tracker kleurstof of met het uitspreken van een fluorescerend eiwit. We tonen de adoptieve overdracht procedure van het injecteren van cellen afkomstig van donor muizen in de staartader van een ontvanger dier, waar ze thuis van lymfoïde organen binnen ongeveer 15-30 minuten. Illustreren we de isolatie van een lymfeklier en beschrijven methoden om een goede montage van de weggesneden lymfeklier te verzekeren. Andere overwegingen, zoals een goede oxygenatie van geperfuseerde media, temperatuur, en de laser power worden besproken. Tot slot presenteren we 3D-videobeelden van naïeve CD4 + T-cellen vertonen een steady state motiliteit bij 37 ° C.
In deze video protocol laten we de procedures voor de adoptieve cel overdracht en lymfeklier isolatie en de voorbereiding die nodig zijn voor beeldvorming lymfocyten motiliteit in een perifere lymfeklier. Twee-foton beeldvorming heeft een aantal voordelen ten opzichte van confocale beeldvorming in beide geëxplanteerd weefsels (hier afgebeeld) en in intravitale preparaten. Met name het gebruik van infra-rood excitatie minimaliseert lichtverstrooiing en maakt voor het afbeelden van ~ 300 micrometer onder het kapsel van de lymfeklier en dieper in sommige weefsels 4. Bovendien is multi-foton excitatie beperkt tot het brandpunt van de doelstelling, het minimaliseren van foto's bleken en weefselbeschadiging buiten kant van het brandvlak. Zoals met elke nieuwe techniek, echter twee-foton imaging is geen wondermiddel en de beperkingen en mogelijke valkuilen moet in gedachten worden gehouden 5. Daarvan is de eis dat – met uitzondering van intrinsieke signalen zoals tweede-harmonische generatie door collageen-cellen van belang moet worden fluorescent gelabelde door extrinsieke probes of door expressie van fluorescerende eiwitten. De indruk wordt dus gewekt dat deze gelabelde cellen zwemmen in een zwarte leegte, en dat in werkelijkheid zijn ze ondergedompeld in, en de interactie met een complexe omgeving van structurele elementen en talloze andere niet-gemerkt, onzichtbaar cellen.
In de zes jaar sinds de invoering van twee-foton beeldvorming te immunologie, is deze techniek mogelijk onderzoekers om al lang bestaande vraagstukken aan te pakken door rechtstreeks visualiseren in intacte levende weefsels processen, zoals cel-cel interacties, celbeweeglijkheid en lokalisatie, cellulaire signaalwegen en cytotoxische cel het doden van evenementen. Het veld heeft zich snel ontwikkeld dan de eerste fenomenologische beschrijvingen, en kwantitatieve analyses, samen met de computer modellering en simulatie beginnen nu te voelen hoe de schijnbaar chaotische bewegingen en cellulaire interacties binnen lymfeklieren leiden tot een efficiënte immuunrespons te maken. Deze vooruitgang is uitgebreid besproken in een recente publicatie 1, die bevat meer dan 100 papers beschrijven van de toepassing van twee-foton microscopie voor immunoimaging.
We willen Rebecca Paquette bedanken voor hulp bij het reagens voorbereiding. MPM wordt ondersteund door een Ruth L. Kirchstein predoctorale beurs van de National Institutes of Health en de ondersteuning uit subsidies GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48.071 (IP) ook van de National Institutes of Health.