Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l'analisi delle interazioni proteina-lipide
Summary
Per verificare l'interazione di una proteina con la sua lipidi obiettivo abbiamo utilizzato MACS e sfere magnetiche annessina V-coniugati e vescicole lipidiche sintetizzato dal lipidi target e annessina V-binding fosfatidilserina. Le proteine legate alla lipidi target sono co-purificati e analizzati dopo eluizione dal perline.
Abstract
L'analisi delle interazioni lipidi proteine è difficile perché i lipidi sono incorporati nelle membrane cellulari e quindi inaccessibili alla maggior parte delle procedure di purificazione. In alternativa, i lipidi possono essere rivestiti su superfici piane come usato per lipidi ELISA e Plasmon spettroscopia di risonanza. Tuttavia, lipidi rivestimento superficiale non formano strutture microdomini, che possono essere importanti per le proprietà dei lipidi vincolanti. Inoltre, questi metodi non consentono per la purificazione di grandi quantità di proteine leganti i lipidi alla loro destinazione.
Per superare queste limitazioni dei test interazioni lipidi e proteine per purificare lipidi proteine leganti abbiamo sviluppato un nuovo metodo chiamato vescicola lipidica mediata cromatografia di affinità utilizzando magnetica attivata cell sorting (LIMACS). In questo metodo, vescicole lipidiche sono preparati con i lipidi di destinazione e fosfatidilserina come lipidi di ancoraggio per annessina V MACS. Fosfatidilserina è un fosfolipide onnipresente membrana cellulare che mostra alta affinità per la proteina annessina V. Utilizzando sfere magnetiche annessina V coniugata con la fosfatidilserina contenenti vescicole lipidiche si legano al sfere magnetiche. Quando le vescicole lipidiche sono incubati con una cella lisato il legame proteico al lipidi obiettivo sarà anche legato ai talloni, possono essere co-purificato con MACS. Questo metodo può essere utilizzato anche per verificare se le proteine ricombinanti ricostituire un complesso proteina legante al lipidi di destinazione.
Abbiamo usato questo metodo per mostrare l'interazione di atipica PKC (aPKC) con la ceramide sfingolipidi e di co-purificare risposta apoptosi prostata 4 (PAR-4), una proteina vincolante per ceramide associati aPKC. Abbiamo inoltre usato questo metodo per la ricostituzione di un complesso di ceramidi associato di aPKC ricombinante con la cella polarità proteine correlate Par6 e Cdc42. Dal momento che le vescicole lipidiche possono essere preparati con una varietà di sphingo o fosfolipidi, LIMACS offre un test versatile per lipidi-proteina in un ambiente lipidico che ricorda da vicino quella della membrana cellulare. Ulteriori lipidi complessi proteici possono essere identificati mediante l'analisi proteomica di proteine lipidi legame co-purificato con le vescicole lipidiche.
Protocol
Discussion
Per testare l'interazione specifica tra un lipide e il suo legame con le proteine è ostacolata dalla incorporazione di lipidi nella membrana cellulare. La membrana cellulare è costituita da una miscela di lipidi e proteine diverse, ed è organizzato in microdomini lipidici o zattere. Pertanto, il co-purificazione di proteine microdomini e non è possibile distinguere se una proteina che si lega direttamente a un lipidi o è solo arricchito in una struttura microdomini. Altri metodi utilizzando li…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NIH R01NS046835 e R01AG034389, e il March of Dimes concedere 6FY08-322. Un ringraziamento speciale è dedicata alla signora Eleonora Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) che ha contribuito enormemente con la sua comprensione della tecnologia MACS. Miltenyi ha generosamente fornito il materiale utilizzato per la dimostrazione degli esperimenti senza alcun costo. Sono anche grato al Dr. Guanghu Wang (Medical College della Georgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA), che ha generato il PKCζ esprimere linee cellulari. Supporto per l'Istituto di Medicina Molecolare presso il Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University (in direzione del Dott. Lin Mei) è anche riconosciuto.
Materials
Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns were provided by Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). All lipids were of highest purity and obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).
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