निस्र्पक बैक्टीरियल माध्यमिक Electrospray Ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (SESI एमएस) का उपयोग वाष्पशील

Summary

माध्यमिक electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (SESI एमएस) वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों (VOCs) का पता लगाने के किसी भी नमूने pretreatment के लिए आवश्यकता के बिना सक्षम बनाता है. इस प्रोटोकॉल बैक्टीरियल SESI – एमएस का उपयोग कर VOCs की तेजी लक्षण वर्णन (मिनट के भीतर) के लिए निर्देश प्रदान करता है है.

Abstract

माध्यमिक electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (SESI एमएस) एक अस्थिर यौगिकों के तेजी से पता लगाने के लिए नमूना pretreatment के लिए आवश्यकता के बिना, विधि विकसित की है. विधि पहले फेन और ¹ सहयोगियों द्वारा वर्णित किया गया था और अवैध ² दवाओं और विस्फोटकों ^3-4, त्वचा ⁵ वाष्पशील के लक्षण वर्णन, ^और 6-7 सांस के विश्लेषण का पता लगाने के के लिए लागू किया गया है.

SESI ionization प्रोटॉन हस्तांतरण प्रतिक्रियाओं द्वारा electrospray समाधान और अस्थिर analyte के बीच होता है, और इसलिए असमलैंगिक कार्बनिक अणुओं के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है, बस पारंपरिक electrospray ionization (ईएसआई) के रूप में. हालांकि, मानक ईएसआई के विपरीत, SESI प्रोटॉन हस्तांतरण की प्रक्रिया के समाधान में वाष्प के बजाय चरण (1 छवि) में होता है, और इसलिए SESI सबसे अच्छा कार्बनिक वाष्पशील और एयरोसौल्ज़ का पता लगाने के लिए अनुकूल है.

हम जीवाणु पहचान और लक्षण वर्णन ⁸ के लिए एक विधि के रूप में SESI एमएस बैक्टीरियल वाष्पशील का पता लगाने के लिए उपयोग का विस्तार कर रहे हैं. हमने दिखा दिया है कि SESI एमएस अस्थिर फिंगरप्रिंटिंग, एक सांख्यिकीय विश्लेषण विधि के साथ संयुक्त, बैक्टीरियल पीढ़ी, प्रजातियों, और मिश्रित संस्कृतियों वृद्धि मीडिया के एक किस्म में अंतर करने के लिए इस्तेमाल ^किया जा सकता है 8 यहाँ हम बैक्टीरियल अस्थिर SESI का उपयोग कर उंगलियों के निशान को प्राप्त करने के लिए कदम प्रदान करते हैं. वाद्य पैरामीटर है कि मजबूत जीवाणु पहचान और लक्षण वर्णन सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए सहित एमएस,.

Protocol

चित्रा 1 SESI एमएस बैक्टीरियल वाष्पशील के विश्लेषण के लिए योजनाबद्ध. जीवाणु संस्कृति की headspace SESI प्रतिक्रिया कक्ष (2) में सीओ 2 (1) द्वारा विस्थापित है. के रूप में वाष्पशील पार SESI प्रतिक्रिया कक्ष वे electrospray बादल के माध्यम से गुजरती हैं और ionized बन (3). एक बार ionized, वाष्पशील विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर (4) में खींच रहे हैं. अतिरिक्त वाहक गैस और unreacted बैक्टीरियल वाष्पशील 0.22 सुक्ष्ममापी फ़िल्टर (5) के माध्यम से पारित कर रहे हैं, संरक्षण के एक अतिरिक्त उपाय के रूप में, और एक रासायनिक हुड के लिए दिए. इनसेट: SESI electrospray सुई एक तेज सुई टिप के साथ केशिका (40 सुक्ष्ममापी आईडी) सिलिका है. बैक्टीरियल वाष्पशील, ई. के लक्षण वर्णन के लिए SESI एमएस के उपयोग के एक प्रदर्शन के रूप में कोलाई K12 और पी. aeruginosa PAO1 aerobically 50 एमएल लेग बाइ लेनोक्स में 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत 37 पर ° सी और SESI एमएस headspace वाष्पशील के स्पेक्ट्रा में 2 मिनट में एकत्र कर रहे हैं . 2 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर कार्बन डाइऑक्साइड (99.99%) प्रतिक्रिया कक्ष अस्थिर प्रसव के लिए वाहक गैस के रूप में प्रयोग किया जाता है. SESI प्रतिक्रिया कक्ष कस्टम बनाया और एक (SCIEX) एपीआई-3000, मूल electrospray आयन स्रोत की जगह के लिए फिट था. स्पेक्ट्रा सकारात्मक आयन 0.1% चींटी एसिड, मेथनॉल 5.0%, और electrospray समाधान के रूप में 94.9% पानी (v / v) का उपयोग मोड में एकत्र कर रहे हैं, 5 में दिया / एक तेज सुई टिप के साथ एक गैर प्रवाहकीय सिलिका केशिका के माध्यम से एस NL (40 सुक्ष्ममापी आईडी). लागू वोल्टेज 2.5 केवी है. – डा 500,, 40 एमसीए मोड स्कैन, 3 / एस स्कैन, और 2 मिनट कुल विश्लेषण के समय 20: विश्लेषक सॉफ्टवेयर 1.4.2 (एप्लाइड Biosystems) डेटा संग्रह के लिए निम्न पैरामीटर के साथ प्रयोग किया जाता है. 1. संवर्धन प्रणाली अपने संस्कृतियों उगाने के लिए उपयुक्त पोत चुनें अपने प्रयोग (जैसे, वातन, प्रकाश, तापमान, आदि) के रूप में अच्छी तरह के रूप में मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए वाष्पशील के कुशल वितरण में प्रजातियों के विकास की आवश्यकताओं पर विचार. संस्कृति की बोतलें हम उपयोग करने के लिए चुनते हैं मानक 100 एमएल Pyrex मीडिया लड़ी पिरोया टोपी है कि कम से कम दो luer बंदरगाहों है के साथ फिट की बोतलें हैं. एक इनलेट लाइन वाहक गैस नमूना बोतल के वितरण और एक दुकान लाइन साधन VOC वितरण (चित्रा 1) के लिए एक बंदरगाह के माध्यम से डाला जाता है के लिए एक luer पोर्ट के माध्यम से डाला जाता है. किसी भी अतिरिक्त बंदरगाहों में खामियों को दूर कर रहे हैं. नमूने संवर्धन करने से पहले, जहाजों और पानी में डूब दबाव लीक की जांच करने के लिए. गैस लीक कमजोर या अनुपस्थित अस्थिर आयन संकेतों के रूप में atypical परिणाम का एक प्रमुख कारण हैं. 2. जैविक प्रयोग: सेट अप और सुरक्षा के विचार अपने परिकल्पना के लिए उपयुक्त परिस्थितियों में अपने संस्कृतियों हो जाओ. यह अनुशंसा की जाती है कि कम से कम दो जैविक प्रतिकृति, दोनों के साथ प्रत्येक तकनीकी प्रतिकृति, प्रत्येक चर के लिए उपयोग किया जाता है. हर संस्कृति हालत के लिए एक रिक्त तैयार (मध्यम, एंटीबायोटिक दवाओं, आदि) और अपने नमूने के रूप में एक ही शर्तों के तहत रिक्त सेते हैं. सुरक्षा सावधानियों कि आप उपयोग कर रहे हैं जैविक एजेंटों के लिए उपयुक्त हैं, ध्यान में प्रजातियों के जैव सुरक्षा स्तर (s) लेने रोजगार. अपने साधन और व्यवहार्य जैविक एजेंटों के साथ गैस हस्तांतरण लाइनों के प्रदूषण को रोकने के लिए उचित रोमकूप आकार के वाहक गैस लाइन में फिल्टर स्थापित करें. फिल्टर वाष्पशील SESI प्रतिक्रिया कक्ष के हस्तांतरण के साथ हस्तक्षेप नहीं है, लेकिन थोड़ा एयरोसोल हस्तांतरण की दक्षता प्रभाव हो सकता है 6 . द्वितीयक रोकथाम या एक जैव सुरक्षा कैबिनेट का प्रयोग करें जब अपनी संस्कृति की बोतल के लिए गैस हस्तांतरण टोपी संलग्न करने के लिए जैविक एजेंट spilling के मामले में उचित रोकथाम आश्वासन. आरंभ और एक तरीका है कि बोतल के अंदर दबाव का निर्माण नहीं होगा में अपने नमूना बोतल वाहक गैस प्रवाह समाप्त. 3. साधन अनुकूलन नोट: SESI एमएस विशेष रूप से नमूना वाष्पशील करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, तो साधन का उपयोग करने से पहले सुगंधित व्यक्तिगत देखभाल आइटम (उदाहरण के लिए, कोलोन, mouthwash, लोशन, फ़ैब्रिक सॉफ़्नर), गोंद, सिगरेट, आदि के उपयोग की सीमा. कसकर प्रयोगशाला में सभी वाष्पशील रसायनों टोपी, और नियंत्रण हवा में परीक्षण के दौरान जितना संभव ड्राफ्ट. निम्नलिखित वाद्य पैरामीटर, जो सभी संकेत तीव्रता और स्थिरता को प्रभावित करने के लिए अपने साधन और प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता होगी. Electrospray समाधान और प्रवाह की दर: आप लक्षित करना चाहते अणुओं के वर्ग के लिए उपयुक्त electrospray समाधान चुनें, ऑपरेटिंग साधन (सकारात्मक या नकारात्मक आयन मोड) की polarity और लक्ष्य यौगिकों के आणविक चरित्र के खाते में ले. इस प्रयोग में electrospray समाधान 0.1% चींटी एसिड, मेथनॉल 5.0%, 94.9% (v / v) पानी है, जो कम ध्रुवीय अणु के संकेत तीव्रता को बढ़ाती है whilई अच्छा संकेत स्थिरता प्रदान. समाधान 5 nl / एस के प्रवाह की दर पर दिया जाता है कैरियर गैस प्रवाह दर: वाहक गैस प्रवाह दर electrospray स्थिरता और संकेत तीव्रता को प्रभावित कर सकते हैं. 2 2 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर सीओ (≥ 99.99%) यहां इस्तेमाल किया है. सुई आकार और स्थिति: सुई टिप आकार और स्थिति दृढ़ता से संकेत तीव्रता और स्थिरता को प्रभावित . जब एक नए सुई स्थापित, सुई की स्थिति कम पृष्ठभूमि, उच्च analyte संकेत तीव्रता, और संकेत स्थिरता के बीच एक संतुलन बनाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. आदेश में एक सुई बदलाव के बाद SESI स्पेक्ट्रा प्रतिलिपि करने के लिए, यह आवश्यक है समय समय पर स्पेक्ट्रा एकत्र करने के रूप में आप सुई की स्थिति को समायोजित जब तक आप अपने रिकॉर्ड के लिए मनाया स्पेक्ट्रम मैच में सक्षम हैं. electrospray सुई टिप से मास कल्पना छिद्र दूरी 1 – 5 मिमी. लागू वोल्टेज: वोल्टेज है कि व्यवस्था करने के लिए लागू किया जाता है संकेत आयन तीव्रता और electrospray टेलर शंकु की स्थिरता को प्रभावित करता है. इसके अतिरिक्त, इष्टतम वोल्टेज अपने electrospray समाधान और सुई टिप आकार पर निर्भर है. अपने प्रयोगों की श्रृंखला के शुरू में, वोल्टेज है कि आपके सिस्टम के लिए इष्टतम स्पेक्ट्रम और संकेत स्थिरता पैदावार निर्धारित, और फिर बाद के सभी प्रयोगों के लिए इस वोल्टेज का उपयोग. हमारी प्रणाली के लिए 2.0 के लागू voltages – 5.0 केवी इष्टतम संकेत तीव्रता और electrospray स्थिरता प्रदान करते हैं. इस प्रयोग के लिए 2.5 केवी प्रयोग किया जाता है. 4. पर टर्निंग और विश्लेषण के लिए SESI एमएस ट्यूनिंग यह सुनिश्चित करना है कि वोल्टेज की आपूर्ति बंद कर दिया है और प्रणाली है कि बिजली की छुट्टी है के द्वारा शुरू करो. 1 से यह मत करो) सुनिश्चित करना है वोल्टेज की आपूर्ति पर सूचक रोशनी बंद कर रहे हैं, 2) मल्टीमीटर पर वोल्टेज सुनिश्चित करने के शून्य है, और 3) बिजली के सुराग ग्राउंडिंग. अपने प्रयोग के लिए उचित electrospray समाधान स्थापित करें. वाहक गैस पर मुड़ें और अपने प्रयोग के लिए उपयुक्त दर प्रवाह सेट. Electrospray जलाशय दबाव electrospray कक्ष प्रतिक्रिया के लिए समाधान की डिलीवरी आरंभ लागू करें. वोल्टेज की आपूर्ति चालू करें और अपने प्रयोगों के लिए एक उचित मूल्य के लिए वोल्टेज समायोजित. नोट: इस बिंदु पर ionization स्रोत धातु सतहों एक खतरनाक झटका देने में सक्षम हैं. महान व्यायाम सावधानी जब साधन के आसपास काम कर रहे एक बार वोल्टेज की आपूर्ति पर दिया गया है. SESI – एमएस स्पेक्ट्रम की निगरानी जबकि वोल्टेज लागू करने के लिए ठीक tuned समायोजन करने के लिए एक ट्यूनिंग विधि सेट करें. अधिग्रहण पैरामीटर है कि आप अपने सिस्टम और अपने प्रयोग के लिए अनुकूलित है का उपयोग करें. एकाधिक चैनल अधिग्रहण (एमसीए) चेक बॉक्स (यदि लागू हो) इतना साफ़ है कि हर स्कैन एक स्वतंत्र स्पेक्ट्रम का उत्पादन करने के लिए, 10 को अधिग्रहण समय सेट – 15 मिनट, और अधिग्रहण शुरू. वाहक गैस पृष्ठभूमि के स्पेक्ट्रा अब मनाया जाना चाहिए. एक स्थिर कुल आयन chromatogram (घरेलू) और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्कैन है कि अपने पिछले प्रयोगों के लिए सीओ 2 स्कैन मैच प्राप्त करने के लिए लागू वोल्टेज ठीक tuned समायोजन करें. एक बार वोल्टेज का समायोजन किया गया है, पांच मिनट के लिए सुनिश्चित साधन स्थिर है के लिए स्पेक्ट्रा और एक घरेलू इकट्ठा जारी है. एक बार महत्वपूर्ण भूमिका निभाई स्थिरता सुनिश्चित है, अपने नमूनों के लिए उपयुक्त के रूप में अधिग्रहण विधि की स्थापना, अधिग्रहण समय, डेटा श्रेणी का समायोजन, और एमसीए चयन के रूप में की जरूरत है. अपने रिकॉर्ड के लिए एक वाहक गैस पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम लीजिए. 5. अपने जीवाणु संस्कृति का एक अस्थिर फिंगरप्रिंट प्राप्त एक खाली स्पेक्ट्रम इकट्ठा करने के लिए, बाईपास लाइनों के माध्यम से वाहक गैस प्रवाह प्रत्यक्ष, और फिर साधन के गैस स्थानांतरण लाइनों को खाली नमूना देते हैं (वाल्व बंद). नमूना बोतल वाल्व खोलें, और बाईपास लाइनों के वाल्व बंद करो. प्रणाली 30 सेकंड के लिए संतुलित करने के लिए, जो समय के दौरान प्रतिक्रिया कक्ष में नमी स्थिर है की अनुमति दें. संतुलन की इस अवधि में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. सुनिश्चित करें कि प्रणाली equilibrated है, आप घरेलू, जो संतुलन की अवधि के दौरान बदल जाएगा की निगरानी करना चाहते हैं, कर सकते हैं और उसके बाद स्थिर है. एक बार इस प्रणाली equilibrated है, स्पेक्ट्रम संग्रह आरंभ करें. स्पेक्ट्रम के बाद एकत्र की है, पहले वाहक गैस बाईपास लाइनों खोलने, तब नमूना वाल्व बंद, और अंत में नमूना बोतल को हटाने के द्वारा नमूना बोतल हटा दें. 2 के लिए वाहक गैस के साथ सिस्टम फ्लश – 4 मिनट हस्तांतरण लाइनों से नमी और वाष्पशील adsorbed को हटाने, नमूना नमूना carryover को रोकने. प्रत्येक जीवाणु नमूने के लिए 5.5 रहकर अतिरिक्त रिक्त स्पेक्ट्रा इकट्ठा करने के लिए पूरी तरह से खाली घटाव सुनिश्चित 5.2 चरणों को दोहराएँ. अधूरा रिक्त घटाव के लिए नेतृत्व करेंगेरासायनिक अपने संसाधित स्पेक्ट्रम में पृष्ठभूमि चोटियों है कि वायुमंडलीय दबाव ionization तकनीक को आम कर रहे हैं की उपस्थिति (जैसे, phthalates, silicones, आदि ) 9. जब अपने स्पेक्ट्रा एकत्रित सुनिश्चित करने के लिए, कि आयन संकेतों को अपने साधन के रैखिक पता लगाने सीमा के रूप में घरेलू और व्यक्तिगत चोटियों की अधिकतम तीव्रता द्वारा निर्धारित से अधिक नहीं कर रहे हैं. अपने साधन डिटेक्टर के ऊपरी सीमाओं से अधिक आयनों artifact के चोटियों कि अपने नमूने के प्रतिनिधि नहीं हैं उत्पन्न कर सकते हैं. 6. प्रतिनिधि परिणाम SESI एमएस स्पेक्ट्रा के एक उदाहरण के रूप में है कि बैक्टीरियल वाष्पशील, सकारात्मक आयन ई. के लिए मोड अस्थिर उँगलियों के निशान के लिए प्राप्त किया जा सकता है कोलाई और पी. लेग बाइ लेनोक्स में aerobically 37 में 24 घंटे के लिए हो aeruginosa ° C (छवि 2) दिखाए जाते हैं . ई. कोलाई अस्थिर स्पेक्ट्रम इण्डोल द्वारा / मीटर z = 118 पर प्रभुत्व है, जो ई. देता है कोली उनकी विशिष्ट गंध, पी. के स्पेक्ट्रम जबकि संस्कृतियों aeruginosa protonatable चोटियों का एक बड़ा विविधता शामिल हैं. कृपया ध्यान दें कि वाष्पशील स्पेक्ट्रम में चोटियों के रिश्तेदार तीव्रता वाद्य धारा 3 में वर्णित मापदंडों पर निर्भर हैं. इन मानकों को कस प्रयोग से प्रयोग करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए क्रम में करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्पेक्ट्रा प्राप्त है. चित्रा 2 खाली – घटाया सकारात्मक आयन SESI एमएस मोड स्पेक्ट्रा (20 – 150 m z /) ई. के. कोलाई K12 और पी. 37 पर 24 घंटे लेग बाइ लेनोक्स में एरोबिक वृद्धि के बाद PAO1 वाष्पशील aeruginosa ° सी. SESI स्पेक्ट्रा में मनाया चोटियों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, झू, एट अल 8. उल्लेख कृपया.

Discussion

जीवाणु वाष्पशील के विभिन्न संयोजनों, जो जीवाणु ^10-12 पहचान और चयापचय की स्थिति का आकलन के लिए उपयोग किया जा सकता है उत्पादन. SESI – एमएस विधि यहाँ वर्णित तेजी से किसी भी नमूना तैयारी के बिना जीवाणु वाष्पशील (दो मिनट या उससे कम में) निस्र्पक, प्रजातियों की पहचान के लिए एक जीवाणु "अंगुलांक" पैदा करने के एक साधन के ^{पिछले} कई दशकों में 8 अन्य वायुमंडलीय दबाव ionization प्रदान करता है. एमएस तकनीकों चयनात्मक आयन प्रवाह (झारना) ट्यूब और प्रोटॉन हस्तांतरण (पीटीआर) प्रतिक्रिया मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित अस्थिर यौगिकों के लक्षण वर्णन के लिए लागू किया गया है. विशिष्ट लाभ है कि SESI इन अन्य ionization तरीकों पर प्रदान करता है कि यह विशिष्ट टुकड़ा (मास स्पेक्ट्रोमीटर के उचित प्रकार प्रदान SESI के लिए अनुकूलित किया गया है) चोटियों, जो यौगिक की पहचान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है करने के लिए संभव है. हम ऊपर सूचीबद्ध प्रोटोकॉल में चोटी विखंडन नहीं पता था, लेकिन कैसे विखंडन जानकारी बैक्टीरियल वाष्पशील के लक्षण वर्णन में इस्तेमाल किया जा सकता है उदाहरण के लिए, झू को संदर्भित ^{करें,} एट अल 8.

SESI एमएस सांस विश्लेषण के माध्यम से बैक्टीरिया फेफड़ों में संक्रमण की स्वस्थानी पता लगाने में करने के लिए प्रत्यक्ष आवेदन किया है, लेकिन यह भी किसी भी सेटिंग है जो अस्थिर नमूने संभव है लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मूत्र, रक्त, और सांस में वाष्पशील, जो चयापचय विकारों के निदान के लिए प्रासंगिक हैं का विश्लेषण, gastroenteric रोग, कैंसर, और पर्यावरण जोखिम, अच्छी तरह से SESI – एमएस के लिए ^{अनुकूल} हैं 13,14 SESI एमएस भी है. गैर चिकित्सीय विशेषता पकने, उम्र बढ़ने, या खराब के साथ जुड़े वाष्पशील के लिए खाद्य पदार्थों के तेजी से विश्लेषण सहित VOC फिंगरप्रिंटिंग अनुप्रयोगों, की एक ^{विस्तृत} श्रृंखला 15-18.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue #	Comment
API-3000 Triple Quadrupole	Instrument	SCIEX		Purchased with Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems)
SESI Ion Source	Instrument			Custom-made; See reference 6
Gas flow meter	Equipment	Cole-Parmer	EW-03217-74
Carbon dioxide	Equipment	Airgas	CD I300	≥ 99.99% pure
Nitrogen	Equipment	Airgas	NI UHP300	Ultra high purity
100 mL glass media bottles	Equipment	VWR	89012-114	GL45 screw threads
Bottle caps with luer ports	Equipment	Bio Chem Fluidics	00945T-3	Cap assembly
Luer port plugs	Equipment	Bio Chem Fluidics	009LP	Cap assembly
Tubing 1/4″ (OD) x 1/8″ (ID)	Equipment	Cole-Parmer	EW-95875-02	Cap assembly & gas transfer lines
Tubing 1/8″ (OD) x 1/16″ (ID)	Equipment	Cole-Parmer	EW-06605-27	Cap assembly
Two-way valves	Equipment	Cole-Parmer	07391-04	Cap assembly
Filter, Grade AAQ	Equipment	Balston Filters	9922-05
Formic acid, LC/MS grade	Reagent	Fisher	A117-05AMP	Electrospray solution
Methanol, LC/MS grade	Reagent	Fisher	A456-500	Electrospray solution
Water, LC/MS grade	Reagent	Fisher	W6-500	Electrospray solution