Summary

Термодинамика Мембранные белки Складные Измеряется флуоресцентной спектроскопии

Published: April 28, 2011
doi:

Summary

Это видео подробно статье экспериментальные процедуры получения свободной энергии Гиббса мембранных складывания белка триптофан флуоресценции.

Abstract

Складные Мембранные белки новые темы с как фундаментальных, так и связанных со здоровьем значение. Обилие мембранных белков в клетках лежит необходимость всестороннего изучения складывания этого вездесущего семейства белков. Кроме того, прогресс в нашей способности характеризуют заболевания, связанные с неправильно упакованных белков побудили значительные экспериментальные и теоретические усилия в области сворачивания белка. Быстрый прогресс в этой важной области, к сожалению, затруднено из-за присущих проблем, связанных с мембраной белков и сложности механизм складывания. Здесь мы опишем экспериментальные методики измерения термодинамических свойств Гиббса свободная энергия разворачивается в отсутствие денатуранта, Δ G ° H 2 O, для представителей интегрального мембранного белка от E. палочки. Этот протокол фокусируется на применение флуоресцентной спектроскопии для определения равновесия популяций свернутых и развернутых состояний в зависимости от денатуранта концентрации. Экспериментальные соображения для подготовки синтетические везикулы липидного, а также основные этапы процедуры анализа данных будут выделены. Этот метод является универсальным и может осуществляться с различными типами денатуранта, включая температуру и рН, а также в различных средах складной липидов и мицеллы. Текущий протокол, который может быть обобщен на любое мембраны или растворимого белка, который отвечает набору критериев обсуждается ниже.

Protocol

1. Подготовка ~ 50 нм Диаметр малого однослойные везикулы (SUV) для мембранных белков Складные Решение 1,2-dimyristoyl-Sn-глицеро-3-фосфохолин (ДМФХ) липидов в хлороформе приобретается и aliquotted в чистые стеклянные флаконы по 20 мг на флакон количествах для хранения. Слой газообразного азот?…

Discussion

Текущий протокол описывает поколение разворачивается кривые мембранно-связанных белков и пептидов, которые содержат триптофан остатков. Здесь предполагается, что флуоресценции триптофана, отражает ли белок складывается и вставляется в синтетические пузырьки липидов, или развернут?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Пекина Ву для использования ее данных. Эта работа была поддержана наградой NSF КАРЬЕРА для Jek

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DMPC   Avanti Polar Lipids 850345C  
Urea   MP Biochemicals 04821527  
Potassium Phosphate Dibasic   Fisher P288  
Potassium Phosphate Monobasic   Fisher P285  

References

  1. Shirley, B. A., Shirley, B. A. . Protein Folding and Stability. , 177-190 (1995).
  2. Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
  3. Lau, F. W., Bowie, J. U. A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein. 생화학. 36, 5884-5892 (1997).
  4. Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro. J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).
  5. Booth, P. J., Curnow, P. Folding scene investigation: membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).
  6. Hong, H., Tamm, L. K. Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).
  7. Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA. 생화학. 47, 12844-12852 (2008).
check_url/kr/2669?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy. J. Vis. Exp. (50), e2669, doi:10.3791/2669 (2011).

View Video