Inmunocitoquímica: células madre neurales humanas

Summary

Inmunocitoquímica es un poderoso método para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitan una para conservar los anticuerpos y sacar el máximo provecho de su coloración.

Abstract

Inmunocitoquímica es un método muy eficaz y sencillo modo leal, para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés, por lo general una proteína, en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitirá a los investigadores para conservar anticuerpos primarios y secundarios al obtener alta calidad, de calidad reproducible y datos cuantitativos de sus manchas. Hay dos aspectos de este protocolo que ayuda a conservar el volumen de los anticuerpos necesarios para la tinción. Por un lado, las células se cultivaron en cubreobjetos pequeños y circulares que se colocan en pocillos de una placa de cultivo de tejidos. Después de la fijación, las células en cubreobjetos se puede quitar de los pozos de la placa. Para la tinción de anticuerpos, el cubreobjetos con las células se invierte en una pequeña gota de solución de anticuerpos en parafina y se cubre con una segunda pieza de parafilm para evitar que se sequen. El uso de este método, sólo aproximadamente 25 l de solución de anticuerpos que se necesita para cada cubreobjetos (o muestra) a teñir. Este protocolo describe la inmunotinción de los derechos humanos madre neurales / células precursoras (hNSPCs), pero se puede utilizar para muchos tipos de células.

Protocol

Día 1: Preparación de las células Cubreobjetos de vidrio alemán y Siembra Nota: cubreobjetos de vidrio alemán son a menudo mejores para el cultivo de células madre neuronales primarias y las neuronas. Usamos el protocolo de limpieza siguientes para mejorar la adhesión celular y la difusión. Cubreobjetos posición en una parrilla pequeña que permitirá el acceso de líquido a ambos lados del cubreobjetos. En primer lugar, los cubreobjetos se incuban en el 1% Liquinox durante 1…

Discussion

Este protocolo describe un procedimiento de inmunotinción para hNSPCs que minimiza el volumen de los anticuerpos necesarios y da la tinción de células confiable. El procedimiento descrito es el mejor de los antígenos intracelulares, pero puede ser modificado para teñir las moléculas de la superficie celular o para mejorar la tinción del citoesqueleto.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological Supply Company	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson Immunoresearch	001-000-161
Hoechst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous