レーザーUncagableフルオレセインデキストランでゼブラフィッシュ細胞の系統ラベリング
Summary
このプロトコルは、uncagedフルオレセインからの信号を増幅するために免疫標識全体のマウントが続くケージフルオレセインのUV -アンケージングを、使用してセルゼブラフィッシュ胚の小グループの運命にラベルを付けたり、トレースする方法を区別します。
Abstract
発生生物学の中心問題は、未分化前駆体から生じるとして、脊椎動物に存在する無数の細胞型の起源を推定することです。研究者は、DIIラベル1とモデルシステムの開発の後期段階で把握細胞の運命にトレーサブルな酵素の圧力注入2のような系統の標識の様々な方法を採用している。ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の最初の運命のマップは、胚の離散的な領域で単一の細胞に、そのようなローダミンデキストランとして、蛍光色素のイオン導入注入によって組み立てられ、時間3-5を介して標識細胞の運命をトレースしていた。効果的な一方で、これらの方法は技術的に要求しており、また一般的にゼブラフィッシュラボでは見られない特殊な装置を必要としている。最近、紫外線にさらされると不可逆的に緑色から赤色蛍光への切り替えなどイーオスや楓などのphotoconvertable蛍光タンパク質は、、、ゼブラフィッシュ6-8の使用の増加を見ている。ゼブラフィッシュ胚や遺伝子導入の相対的な容易さの光学的透明度は、系列ラベリングのためのこれらの特に魅力的なツールを作られているし、in vivoで7に細胞の移動を観察する。それらのユーティリティにもかかわらず、これらのタンパク質は、色素を介した系統の標識方法と比べて不利な点がいくつかある。最も重要な我々はこれらのタンパク質の光変換の間に高い3次元分解能を得るに見ている難しさです。この光の中で、おそらくゼブラフィッシュの系統の標識のための解像度と使いやすさの最適な組み合わせは、ケージフルオレセインデキストランの使用、消光グループにバインドされている蛍光色素になりますそのマスクの蛍光9。染料は、その蛍光または免疫検出の可視化を可能にする、レーザーや水銀ランプからの紫外光を使用して特定のセル内（消光グループから解放さ）"uncaged"することができます。イオン導入の方法とは異なり、ケージフルオレセインは、標準的な注入装置を挿 入することができ、ピンホール10を装備した蛍光顕微鏡でuncaged。さらに、フルオレセインに対する抗体だけuncagedフォームを検出し、エピトープは、固定も11生き残っています。最後に、ケージフルオレセインは、2光子顕微鏡は、12,13を採用している場合は特に、非常に高い3次元分解能をアクティブにすることができます。このプロトコルは、ケージフルオレセインとレーザーのアンケージングによって系統のラベリングの方法を説明します。 Subsequenctly、uncagedフルオレセイン抗体で標識することによりGFPなどの他のエピトープと同時に検出される。
Protocol
Discussion
説明したように、このプロトコルは、マイクロインジェクション、顕微鏡、および免疫蛍光の一般的に使用される技術に基づいて構築されているゼブラフィッシュでは比較的速い系統の標識法を提供する。我々は、レーザーは、ローカライズされた形でフルオレセインを刑務所から出すために最も効率的かつコスト効果の高い方法であることがアンケージングことを発見した。このメソッド?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ケージフルオレセインを作る際に助けのためにダンカーリンに感謝します。さらに、我々は次の資金源に感謝したい：JACに発生生物学の訓練助成金のためのヴァンダービルト大学医学部のプログラムを、とNIH HD054534to JTG。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
References
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