Lineage Märkning av Zebrafish Celler med laser Uncagable Fluorescein Dextran
Summary
Detta protokoll skisserar ett sätt att märka och spåra öde små grupper av celler zebrafisk embryon med hjälp av UV-uncaging i bur fluorescein, följt av hela berget immunolabeling att förstärka signalen från uncaged fluorescein.
Abstract
Ett centralt problem i utvecklingsbiologi är att härleda ursprunget till de otaliga celltyper som förekommer i ryggradsdjur, eftersom de härrör från odifferentierade förstadier. Forskare har använt olika metoder för härstamning märkning, såsom DII märkning 1 och tryck injektion av spårbar enzymer 2 att ta reda på cell öde i senare skeden av utvecklingen i modellsystem. Den första öde Kartorna i zebrafisk (Danio rerio) samlades av jontoforetiskt injektion av fluorescerande färger, såsom Rhodamine dextran, i enstaka celler i diskreta delar av embryot och spåra den märkta cellens öde över tiden 3-5. Medan effektiva är dessa metoder kräver tekniskt och kräver specialiserad utrustning som inte är vanliga i zebrafisk laboratorier. Nyligen har photoconvertable fluorescerande proteiner, som Eos och Kaede, som oåterkalleligt växlar från grönt till rött fluorescens när de utsätts för ultraviolett ljus, ser en ökad användning i zebrafisk 6-8. Den optiska klarhet zebrafisk embryot och relativt lätt att genmodifiering har gjort dessa särskilt intressant verktyg för härstamning märkning och att observera migration av celler in vivo 7. Trots deras nytta, har dessa proteiner vissa nackdelar jämfört med dye-medierad metoder härstamning märkning. Det mest avgörande är hur svårt vi har funnit att få höga 3-D-upplösning under photoconversion av dessa proteiner. I ljuset av detta, kanske den bästa kombinationen av upplösning och användarvänlighet för härstamning märkning zebrafisk använder sig av bur fluorescein dextran, en fluorescerande färg som är bunden till en släcka grupp som döljer dess fluorescens 9. Färgen kan sedan "uncaged" (frisätts från släckning gruppen) inom en viss cell med hjälp av UV-ljus från en laser eller kvicksilverlampa, vilket gör visualisering av dess fluorescens eller immunodetection. Till skillnad från jontoforetiskt metoder kan bur fluorescein injiceras med standard injektion apparater och uncaged med ett epifluorescensmikroskop försedd med ett hål 10. Dessutom antikroppar mot fluorescein upptäcka bara uncaged form och epitop överlever fixering väl 11. Slutligen kan bur fluorescein aktiveras med mycket hög 3-D-upplösning, särskilt om två-photon mikroskopi är anställd 12,13. Detta protokoll beskriver en metod för härstamning märkning av bur fluorescein och laser uncaging. Subsequenctly är uncaged fluorescein upptäcks samtidigt med andra epitoper som GFP genom märkning med antikroppar.
Protocol
Discussion
Som beskrivits ger detta protokoll en relativt snabb metod härstamning märkning zebrafisk som är byggd på de vanligaste teknikerna för mikroinjektion, mikroskopi och immunofluorescens. Vi har funnit att laser uncaging att vara den mest effektiva och kostnadseffektiva sättet att uncage fluorescein i en lokal sätt. Denna metod kan användas för härstamning etikett med experimentella ändpunkter så sent som 4 DPF. Men eftersom cellerna delar, den bur-fluorescein koncentration per cell sjunker så småningom borto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dan Carlin om hjälp att göra bur fluorescein. Dessutom vill vi tacka följande finansieringskällor: Vanderbilt University Medical School Program för utvecklingsbiologi Utbildning Bidrag till JAC, och NIH HD054534to JTG.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
References
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. , 1-8 (1991).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
- Haugland, R. P. . Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 707-711 (2002).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).
