Induction de l'alloantigène spécifique anergie dans les cellules mononucléaires du sang périphérique par stimulation alloantigène avec blocage du signal de co-stimulation

Summary

Cet article décrit une technique simple pour induire l'anergie alloantigène spécifique dans les cellules mononucléées du sang périphérique. La technique peut être appliquée en clinique pour générer des cellules de donneurs non-alloréactifs. La perfusion de ces cellules pourrait améliorer la reconstitution immunitaire et réduire la toxicité après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques.

Abstract

Allogénique de cellules souches hématopoïétiques (AHSCT) offre les meilleures chances de guérison de nombreux patients atteints de maladies congénitales et acquises hématologiques. Malheureusement, la transplantation de cellules T du donneur alloréactifs qui reconnaissent et endommager les tissus sains du patient peut entraîner la réaction du greffon contre l'hôte (GvHD) ^1. Un défi pour AHSCT succès est la prévention de la GvHD sans déficience associée aux effets bénéfiques des cellules T du donneur, en particulier la reconstitution immunitaire et la prévention de la rechute. GvHD peuvent être évités par des non-spécifique déplétion des cellules T du donneur de greffes de cellules souches ou par l'administration de l'immunosuppression pharmacologique. Malheureusement, ces infections augmentation des approches et la maladie récidive ^2-4. Une autre stratégie consiste à réduire de manière sélective les cellules T du donneur alloréactifs après allostimulation antigène par les cellules présentatrices bénéficiaires (APC) avant la transplantation. Les premiers essais cliniques de ces stratégies allodepletionamélioré la reconstitution immunitaire après greffe de CSH HLA-incompatibles sans excès GvHD ^{5, 6.} Cependant, certaines techniques nécessitent allodepletion spécialisée destinataire APC production ^{6, 7} et certaines approches peuvent avoir des effets hors-cible, y compris la déplétion des cellules T donateurs pathogènes spécifiques ⁸ et T CD4 des cellules régulatrices ^9. Une approche alternative est l'inactivation des cellules T du donneur alloréactifs via l'induction de l'allo-hyporéactivité spécifique. Ce résultat est obtenu en stimulant les cellules du donneur avec le bénéficiaire APC tout en assurant le blocage de CD28 à médiation signaux de co-stimulation ^10. Cette «alloanergization" approche réduit alloréactivité par 1-2 logs tout en préservant pathogènes et des réponses associées à la tumeur d'antigènes de cellules T in vitro ¹¹ . La stratégie a été employée avec succès dans les 2 complété et 1 en cours d'études cliniques pilotes où alloanergized lymphocytes T du donneur ont été perfusés pendant ou après HLA-incompatibles HSCT résultant de reconstitution immunitaire rapidetion, peu d'infections moins sévères et GvHD aiguë et chronique que les bénéficiaires de contrôle historiques de non manipulé HLA-incompatibles transplantation ^12. Ici, nous décrivons notre protocole actuel pour la génération de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) qui ont été alloanergized à HLA-incompatibles PBMC stimulateur indépendants. Alloanergization est atteint par allostimulation en présence d'anticorps monoclonaux dirigés contre les ligands B7.1 et B7.1 pour bloquer CD28 médiée par co-stimulation. Cette technique ne nécessite pas la production de l'APC et spécialisée stimulateur est simple à réaliser, ne nécessitant qu'une seule étape et relativement brève incubation ex vivo. En tant que tel, l'approche peut être facilement normalisé pour l'utilisation clinique de générer des cellules T avec des bailleurs de fonds alloréactivité réduite, mais en conservant un agent pathogène spécifique immunité pour le transfert adoptif dans le cadre de AHSCT pour améliorer la reconstitution immunitaire sans GvHD excessive.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Préparation de PBMC</p><ol><li> Procédures de bonnes conditions d'asepsie et les précautions universelles doivent être respectées lors de la conduite de ce protocole.</li><li> Isoler PBMC provenant de donneurs volontaires sains par centrifugation en gradient de densité à l'aide de Ficoll-Hypaque. Sinon cryoconservé PBMC peuvent être réanimé.</li><li> Comptez PBMC viables après coloration au bleu trypan utilisant un hémocytomètre. Remettre en suspension les PBMC dans des milieux de culture complet (CM) à une concentration de 1 million de cellules viables / mL dans un tube de 15 ml Falcon.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Configuration de l'Alloanergizing vrac co-culture</p><ol><li> PBMC de deux donneurs différents sont nécessaires pour mettre en place les cultures alloanergization. Les cellules provenant d'un donneur sera le répondeur et les cellules d'un autre donateur sera le stimulateur (appelé le stimulateur First Party).</li><li> Lieu 10 millions stimulateur PBMC à 1 million / ml dans un tube Falcon de 15 ml et ajouter 100 mg d'anti-B7.1 et B7.2 100mg d'anti anticorps pour bloquer costimulation. Agiter doucement le tube et incuber pendant 30 minutes. Les conditions d'incubation pour cela et toutes les étapes ultérieures sont de 37 ° C CO / 5%<sub> 2</subHumidité> / 80%</li><li> Irradier stimulateur PBMC (33 Gy) et l'ajouter à un 50cm T-25³ Flacon pour la culture de cellules avec un bouchon perméable aux gaz. Etiqueter le flacon "en vrac alloanergizing co-culture".</li><li> Ajouter 10 ml de répondeur PBMC (à 1 million / ml en CM) dans le ballon.</li><li> Ajouter un autre 100mg chacun des anti-B7.1 B7.2 et anti anticorps et mélanger doucement avant de placer le flacon en position verticale dans un incubateur pendant 72 heures</li></ol><p class="jove_title"> 3. Configuration du contrôle en vrac co-culture</p><ol><li> Lieu 10 millions stimulateur PBMC (à 1 million / ml) dans un tube de 15 ml Falcon.</li><li> Irradier 10 millions stimulateur PBMC (33 Gy). Et ajouter à un 50cm³ Flacon de culture cellulaire. Label "en vrac contrôle de co-culture".</li><li> Ajouter 10 ml de répondeur PBMC à 1 million / ml de CM dans le ballon et mélanger doucement avant de placer le flacon en position verticale dans un incubateur pendant 72 heures.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Configuration de la réaction lymphocytaire mixte primaire (MLR) pour mesurer l'efficacité de la co-stimulation blocus</p><ol><li> L'efficacité du blocus de co-stimulation est mesurée dans une MLR primaire qui est mis en place en utilisant des PBMC issues de la alloanergizing en vrac et le contrôle des co-cultures</li><li> Le MLR primaire est mis en place le même jour que les cultures en vrac ont été mis en place</li><li> La première étiquette U creux de plaque à 96 puits "MLR primaire» pour chacun des trois points dans le temps à mesurer (Jour 4, 5 et 6 après plaques sont mis en place).</li><li> 5 ml de chacun des Décanter le contrôle en vrac et alloanergizing co-cultures dans des tubes Falcon de 15 ml.</li><li> Pipette 200 ml de suspension cellulaire dans chaque tube Falcon dans des puits en triple sur chaque assiette. Étiquette ces puits "aucun blocus de costimulation (CSB)" pour les cellules de la commande en vrac co-cultures et de «CSB» pour les cellules de la masse alloanergizing co-cultures</li><li> Ajouter 200 ml de CM à 6 puits sur chaque plaque comme contrôle négatif. 200mL de PBS est ajouté à tous les puits vides pour réduire l'évaporation. Placer les plaques dans l'incubateur.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Configuration du secondaire MLR pour mesurer l'efficacité de Alloanergization</p><ol><li> 72 heures après la mise en place la plus grande partie des co-cultures, alloresponses résiduelles dans les PBMC alloanergized sont mesurées dans une MLR secondaire. Dans le secondaire, MLR, des PBMC à la fois la plus grande partie alloanergizing co-culture et la commande en vrac co-culture sont lavées et restimulées avec allostimulator irradié PBMC</li><li> Pour configurer l'étiquette secondaire MLR un U creux de la vague plaque à 96 puits "MLR secondaire» pour chacun des trois points dans le temps à mesurer (Jour 3, 5 et 7 après mise en place).</li><li> Supprimer 5mL de chacune des commande en vrac et alloanergizing co-cultures, transfert à des tubes Falcon de 15 ml et centrifuger pendant 5-10 minutes à 2000 rpm.Aspirate le surnageant avec précaution, de perturber le culot, ajouter 10 ml de CM et de centrifuger les cellules à nouveau. Répétez cette étape de lavage.</li><li> Reprendre les cellules dans 1 ml de CM. Compter le nombre de cellules viables en utilisant la coloration au bleu trypan, et ajuster la concentration de cellules viables à 1 million de cellules répondeuses / mL.</li><li> Pipette 100 ml de suspension cellulaire dans chaque tube Falcon dans trois puits de chaque plaque. Étiqueter ces puits "Première Partie (FP) allorestimulation"</li><li> Pipette 100 ml de suspension cellulaire dans chaque tube Falcon dans 3 autres puits sur chaque assiette et l'étiquette de ces puits "CD3/28 stimulation"</li><li> Pour préparer cellules stimulatrices pour le secondaire MLR, isoler PBMC à partir de sang frais (ou ressusciter cryoconservé PBMC) provenant du même donneur sain utilisé pour fournir le premier stimulateur PBMC parti dans les cultures alloanergizing et de contrôle.</li><li> Suspendre PBMC du donneur FP à une concentration de 1 million / ml et irradier (33Gy)</li><li> Ajouter 100 ml de cellules stimulatrices irradiées à des puits étiquetés «FP allorestimulation"</li><li> Pour les contrôles positifs, ajouter 1 ml de chacun des anticorps CD3 et CD28 monoclonaux et 98mL de CM aux puits étiquetés «stimulation CD3/28". Ajouter 200 ml de CM à 6 puits sur chaque plaque comme contrôle négatif et 200mL de PBS dans les puits vides. Placer les plaques dans l'incubateur.</li></ol><p class="jove_title"> 6. La mesure de la spécificité de Alloanergization</p><ol><li> La spécificité de alloanergization est déterminée en comparant la prolifération des cellules répondeuses tirés de la alloanergizing terminée et le contrôle des co-cultures après stimulation avec des PBMC irradiés obtenu à partir d'une «tierce partie» donneur sain (c'est à dire d'un donneur différent à la Première Partie) dans un établissement secondaire MLR.</li><li> Étiquette de trois plaques à 96 puits secondaire "Spécificité MLR" Day 3, 5 et 7.</li><li> Supprimer 5mL de chacune des commande en vrac et alloanergizing co-cultures transfert à des tubes Falcon de 15 ml et centrifuger pendant 5-10 minutes à 2000 rpm. Aspirer le surnageant avec précaution, de perturber le culot, ajouter 10 ml de CM et de centrifuger les cellules à nouveau. Répétez cette étape de lavage.</li><li> Reprendre les cellules dans 1 ml de CM. compter en utilisant la coloration au bleu trypan, et ajuster la concentration de cellules viables à 1 million de cellules répondeuses / mL.</li><li> Pour préparer troisième cellules stimulatrices parti pour le secondaire MLR, isoler PBMC à partir de sang frais (ou ressusciter cryoconservé PBMC) provenant d'un donneur sain nouvelle. 100 ml Pipette de suspension cellulaire dans chaque tube Falcon dans trois puits de chaque plaque. Étiqueter ces puits "TP allostimulation"</li><li> Suspendre PBMC d'un donneur TP à 1 million / mL et irradier (33 Gy)</li><li> Ajouter 200 ml de cellules stimulatrices irradiées TP aux puits étiquetés «allostimulation TP"</li><li> La spécificité de alloanergization peut également être déterminée en comparant la prolifération des cellules répondeuses tirés de la alloanergizing terminée et le contrôle des co-cultures après stimulation par un agent pathogène infectieux tels que le CMV. Pour cette étape, il est essentiel d'utiliser répondeur PBMC provenant de donneurs ayant déjà démontré des réponses prolifératives à CMV lysat.</li><li> Étiquette de trois plaques de 96 puits "MLR secondaire CMV" Day 3, 5 et 7.</li><li> Pour préparer les cellules répondeuses pour le MLR secondaire pour mesurer les réponses à CMV, transférer 5 ml de chacune des commande en vrac et alloanergizing co-cultures tubes de 15 ml et laver, compter et remettre en suspension à 1 million de cellules / ml dans CM, comme décrit précédemment . Pipeter 100 ml de suspension cellulaire dans chaque tube Falcon dans un 3 puits sur chaque plaque.</li><li> Ajouter 0,1 ml de lysat CMV dans 100 ul aux puits CM</li><li> Ajouter 200 ml de CM à 6 puits sur toute la plaque comme contrôle négatif et ajouter 200 ml de PBS dans les puits vides. Placer les plaques dans l'incubateur.</li></ol><p class="jove_title"> 7. Mesure de la prolifération dans les RLI primaires et secondaires</p><ol><liProlifération> cellule de répondeur est mesurée par incorporation de thymidine dosage dans les RLI primaires et secondaires. La prolifération est mesurée au Jour 4, 5 et 6 après que les plaques primaires MLR sont mis en place et au Jour 3, 5 et 7 après que les plaques secondaires MLR sont mis en place.</li><li> 1mCi de thymidine tritiée est ajouté au puits 16 heures avant la récolte</li><li> Après l'addition de thymidine tritiée, la plaque est incubée pendant une further16 heures, puis récoltées sur un tapis filtre à l'aide d'une moissonneuse-Tomtec (ou similaire). Sécher à l'air Filtermat pendant une heure puis mettre dans un sac de prélèvement, ajouter 5 ml de liquide de scintillation et le joint. Lire la plaque dans une scintillation Wallac Micro beta compteur ou similaire.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Calcul de l'efficacité des co-stimulation blocus dans le primaire MLR</p><ol><li> Le pourcentage d'inhibition (PI) de alloresponses primaire est calculé comme 100 x [cpm en allostimulation puits (en vrac alloanergy co-culture de PBMC) – cpm en allostimulation puits (en vrac contrôle co-culture de PBMC)}<br /><img src="/files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" ></ol><p class="jove_title"> 9. Calcul de l'efficacité des Alloanergization dans le secondaire MLR</p><p class="jove_content"> Le PI de alloresponses secondaires est calculé comme<br /><img src="/files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" ><p class="jove_title"> 10. Calcul de la spécificité de Alloanergization dans le secondaire MLR</p><ol><li> Après la restimulation de cellules CD3 et CD28 avec, allostimulators TP ou antigène CMV, la PI des réponses à ces stimuli peuvent également être calculées en utilisant cette formule. Ceci donne une mesure de la spécificité du processus de alloanergization</li></ol><p class="jove_title"> 11. Génération PBMC donateurs Alloanergized pour l'utilisation clinique Après allogénique de cellules souches hématopoïétiques (HSCT)</p><ol><lipbmc> Alloanergized des bailleurs de fonds peuvent être générés pour une utilisation clinique après HLA-incompatibles CSH allogénique en utilisant le protocole décrit ci-dessus</li><li> Lors de la génération des cellules à usage clinique, répondeur PBMC sont obtenues à partir du donneur HSCT et stimulateur PBMC du destinataire CSH avant la greffe.</li><li> Lors de la génération PBMC pour une utilisation clinique, toutes les mesures sont effectuées dans des bonnes conditions du processus de fabrication dans les installations de traitement agréées souches cellulaires.</li><li> D'autres analyses de contrôle de qualité sont effectués, y compris des dosages d'endotoxines et de la coloration de Gram et la culture pour répondre aux critères de sécurité avant la libération des cellules pour une utilisation clinique</li></ol><p class="jove_title"> 12. Les résultats représentatifs</p><p class="jove_content"> Utilisation de HLA-incompatibles stimulateur et répondeur PBMC, la présence de blocus costimulation dans la MLR primaire réduit alloproliferation moyenne de répondeur PBMC lors de la Journée 5 à environ 30% (+ / – 10%, la moyenne + / – écart-type) de celle observée dans contrôler MLR primaire en l'absence de blocage de co-stimulation. Cela équivaut à une inhibition moyenne de alloproliferation primaire d'environ 70% (+ / – 10%) à J5,<strong> Figure 1 A et B</strong>.</p><p class="jove_content"> Dans le secondaire MLR au Jour 5, alloproliferation FP de PBMC alloanergized est généralement de 10-15% (+ / – 10%) à celle observée avec le contrôle PBMC correspond à une inhibition de la prolifération moyenne de 85-90% (+ / – 10 %),<strong> Figure 2A et B</strong>. Cela démontre que PBMC alloanergized sont hyporéactivité à allostimulators PF.</p><p class="jove_content"> En revanche alloanergized PBMC généralement conserver 70-100% de leur prolifération aux mitogènes (CD3/CD28 anticorps), allostimulators TP et CMV lysat (CMV en réagissant avec les bailleurs de fonds). Cela démontre que l'hyporéactivité des PBMC alloanergized est spécifique à la PF alloantigènes.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figure 1. A.</strong> Prolifération (déterminée par incorporation de thymidine) dans une réaction lymphocytaire mixte primaire à l'aide HLA-incompatibles stimulateur et cellules répondeuses mononucléées du sang périphérique (PBMC) en l'absence ou la présence de blocus à l'aide de costimulation monoclonal humanisé anti-B7.1-B7.2 et anticorps. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne (+ /-SD) pour 8 expériences représentatives en utilisant uniques stimulateur répondeurs paires.<strong> B</strong>. Pourcentage d'inhibition de alloproliferation dans RLI primaires effectuée en présence de co-stimulation avec blocage monoclonal humanisé anti-B7.1 et B7.2-anticorps. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne (+ /-SD) pour les 8 mêmes uniques stimulateur répondeurs paires représentées sur la figure 1A.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figure 2. A.</strong> Prolifération (déterminée par incorporation de thymidine) dans RLI secondaires où répondeur PBMC de RLI primaires effectuées en l'absence (contrôle PBMC) ou la présence de blocus de costimulation (alloanergized PBMC) sont restimulées avec les stimulateurs irradiés de première partie. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne (+ /-SD) pour les 8 uniques stimulateur répondeurs paires représentées dans la figure 1.<strong> B</strong>. Pourcentage d'inhibition de alloproliferation Première Partie dans les RLI secondaires où répondeur PBMC de RLI primaires effectuées en l'absence (contrôle PBMC) ou la présence de blocus de costimulation (alloanergized PBMC) sont restimulées avec les stimulateurs irradiés de première partie. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne (+ /-SD) pour les 8 uniques stimulateur répondeurs paires illustrés à la figure 1 et la figure 2A.</p>

Discussion

<p class="jove_content"> L'induction de l'allo-hyporéactivité spécifique, ou anergie, des pays donateurs PBMC via allostimulation en présence de co-stimulation blocus est une technique simple pour la génération de donateurs PBMC avec alloréactivité réduite. Nous avons développé le processus en laboratoire et sont actuellement en application de la stratégie à la clinique pour générer des PBMC avec des bailleurs de fonds alloréactivité réduite à diluer pour perfusion après HLA-incompatibles CSH allogénique. L'objectif de l'utilisation de ce traitement est d'améliorer la reconstitution immunitaire sans toxicité excessive. Bien que notre application clinique actuelle de la stratégie se limite à la fixation des allogéniques HSCT, l'approche pourrait être appliquée à d'autres contextes où les dommages causés par les tissus est non désirés réponses des lymphocytes T, telles que le rejet d'une transplantation d'organe solide ou de maladies auto-immunes.</p><p class="jove_content"> Plusieurs réactifs peuvent être utilisés pour le blocage de CD28 à médiation signaux de co-stimulation au cours de la co-culture alloanergization processus. Ici, nous décrivons notre protocole actuel à l'aide de qualité clinique des anticorps monoclonaux murins humanisés dirigés contre les ligands de CD28 (B7.1 et B7.2). Non cliniques de qualité murins anti-humains B7.1 et B7.2 anticorps sont disponibles commercialement auprès de plusieurs fabricants. Alternativement, la protéine de fusion cytotoxique des lymphocytes T antigène (CTLA) 4-immunoglobuline (Ig) peut être utilisé pour bloquer CD28-costimulation pendant le processus de alloanergization. CTLA4-Ig, qui est constitué de la portion extracellulaire de la molécule CTLA4 reliés au récepteur gamma Fc des IgG, se lie avec une grande affinité à B7.1 et B7.2. L'utilisation de CTLA4-Ig se traduit par une efficacité similaire et la spécificité de alloanergization des PBMC humaines.</p><p class="jove_content"> La technique de alloanergization est simple à réaliser. Fraîches ou préalablement cryoconservées PBMC stimulateur peut être utilisé sans aucune variation significative dans le résultat du processus. L'exigence d'une seule étape d'incubation ex vivo relativement courte, sans tri cellulaire procédures minimise le risque de la mort cellulaire et la contamination bactérienne des cellules avant la perfusion qui rend la stratégie relativement simple à appliquer à une échelle clinique.</p><p class="jove_content"> Une des limites de l'approche que nous décrivons (et d'autres approches pour réduire sélectivement alloréactivité des cellules humaines) est l'absence d'une analyse en temps réel pour déterminer alloréactivité résiduelle. Tests de prolifération prendre 3-5 jours pour effectuer la réduction de confirmer et d'alloréactivité cellules générées pour une utilisation clinique doit être administré avant que les résultats de ces dosages soient disponibles. En outre, la mesure de la prolifération des PBMC par incorporation de thymidine, bien que facile à réaliser, les mesures prolifération des lymphocytes B et des sous-ensembles de cellules d'autres, en plus de la prolifération des cellules T. Dilution CFSE colorant de PBMC répondeur peut être utilisée comme un essai de dégagement et permet la détermination du sous-ensemble de cellules T spécifiques alloproliferation. Une façon d'améliorer l'application clinique de notre approche de la stratégie consisterait à développer et valider un test de alloréactivité qui ne prend que quelques heures pour accomplir ce qui pourrait être réalisée avant la libération des cellules alloanergized pour une utilisation clinique.</p><p class="jove_content"> En plus de démontrer la efficiacy de la stratégie, il est également important de confirmer le processus de alloanergization spécificité. Ceci peut se faire facilement par détermination de la conservation relative des alloresponses spécifiques à allostimulators tiers et lorsque les cellules du donneur CMV-réactifs est alloanergized, par la préservation de la réponse proliférative à CMV</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio-Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning, Inc.	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Labware	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac