मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear में Alloantigen विशेष Anergy के सह stimulatory सिग्नल नाकाबंदी के साथ Alloantigen उत्तेजना द्वारा प्रेरण

Summary

यह पत्र एक साधारण मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear में alloantigen विशेष anergy प्रेरित तकनीक का वर्णन करता है. तकनीक चिकित्सकीय लागू किया जा सकता है गैर alloreactive दाता कोशिकाओं उत्पन्न. इन कोशिकाओं के आसव प्रतिरक्षा पुनर्गठन में सुधार और allogeneic hematopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद विषाक्तता को कम कर सकता है.

Abstract

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic diseases. Unfortunately, transplantation of alloreactive donor T cells which recognize and damage healthy patient tissues can result in Graft-versus-Host Disease (GvHD)¹. One challenge to successful AHSCT is the prevention of GvHD without associated impairment of the beneficial effects of donor T cells, particularly immune reconstitution and prevention of relapse. GvHD can be prevented by non-specific depletion of donor T cells from stem cell grafts or by administration of pharmacological immunosuppression. Unfortunately these approaches increase infection and disease relapse^2-4. An alternative strategy is to selectively deplete alloreactive donor T cells after allostimulation by recipient antigen presenting cells (APC) before transplant. Early clinical trials of these allodepletion strategies improved immune reconstitution after HLA-mismatched HSCT without excess GvHD^{5, 6}. However, some allodepletion techniques require specialized recipient APC production^{6, 7}and some approaches may have off-target effects including depletion of donor pathogen-specific T cells⁸and CD4 T regulatory cells⁹.One alternative approach is the inactivation of alloreactive donor T cells via induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness. This is achieved by stimulating donor cells with recipient APC while providing blockade of CD28-mediated co-stimulation signals¹⁰.This “alloanergization” approach reduces alloreactivity by 1-2 logs while preserving pathogen- and tumor-associated antigen T cell responses in vitro¹¹. The strategy has been successfully employed in 2 completed and 1 ongoing clinical pilot studies in which alloanergized donor T cells were infused during or after HLA-mismatched HSCT resulting in rapid immune reconstitution, few infections and less severe acute and chronic GvHD than historical control recipients of unmanipulated HLA-mismatched transplantation¹². Here we describe our current protocol for the generation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which have been alloanergized to HLA-mismatched unrelated stimulator PBMC. Alloanergization is achieved by allostimulation in the presence of monoclonal antibodies to the ligands B7.1 and B7.1 to block CD28-mediated costimulation. This technique does not require the production of specialized stimulator APC and is simple to perform, requiring only a single and relatively brief ex vivo incubation step. As such, the approach can be easily standardized for clinical use to generate donor T cells with reduced alloreactivity but retaining pathogen-specific immunity for adoptive transfer in the setting of AHSCT to improve immune reconstitution without excessive GvHD.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. PBMC की तैयारी</p><ol><li> प्रक्रियाएं अच्छा सड़न रोकनेवाला तकनीक और सार्वभौम सावधानियों के लिए इस प्रोटोकॉल के संचालन के दौरान पालन किया जाना चाहिए.</li><li> स्वस्थ स्वयंसेवक दाताओं से घनत्व ढाल Ficoll – Hypaque का उपयोग centrifugation द्वारा PBMC पृथक. वैकल्पिक रूप से cryopreserved PBMC पुनर्जीवित किया जा सकता है.</li><li> Trypan ब्लू के साथ धुंधला हो जाना एक hemocytometer का उपयोग करने के बाद व्यवहार्य PBMC गिन लो. पूरा संस्कृति मीडिया में Resuspend PBMC एक 15ml फाल्कन ट्यूब में 1 मिलियन व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में (मुख्यमंत्री).</li></ol><p class="jove_title"> 2. थोक Alloanergizing सह – संस्कृति की स्थापना</p><ol><li> PBMCs दो अलग दाताओं से alloanergization संस्कृतियों सेट की जरूरत है. एक दाता से कोशिकाओं के रूप में प्रत्युत्तर और अन्य दाता से कोशिकाओं उत्तेजक औधधि (पहले पार्टी करार दिया उत्तेजक औधधि) के रूप में काम करेगा करने के लिए की सेवा करेंगे.</li><li1 लाख 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में मिलीग्राम /> प्लेस में 10 मिलियन उत्तेजक औधधि PBMC और विरोधी B7.1 और विरोधी B7.2 costimulation ब्लॉक एंटीबॉडी के 100mg 100mg जोड़ने. धीरे ट्यूब आंदोलन और 30 मिनट के लिए सेते हैं. इस और बाद के सभी चरणों के लिए ऊष्मायन की स्थिति 37 ° सी / 5% सीओ कर रहे हैं<sub2></sub/>% नमी</li><li> चमकाना उत्तेजक औधधि PBMC (3.3 Gy) और T-25 50cm को जोड़ने³ गैस पारगम्य एक टोपी के साथ सेल संस्कृति कुप्पी. फ्लास्क "alloanergizing थोक सह संस्कृति" लेबल.</li><li> फ्लास्क 10ml (1 मिलियन में मुख्यमंत्री मिलीग्राम /) के प्रत्युत्तर PBMC जोड़ें.</li><li> एक और आगे विरोधी B7.1 और विरोधी B7.2 एंटीबॉडी के प्रत्येक 100mg जोड़ें और 72 घंटे के लिए धीरे फ्लास्क एक मशीन में ईमानदार रखने के लिए पहले मिश्रण</li></ol><p class="jove_title"> 3. थोक नियंत्रण सह – संस्कृति की स्थापना</p><ol><li> प्लेस एक 15ml फाल्कन ट्यूब में 10 लाख उत्तेजक औधधि PBMC (1 लाख मिलीलीटर /).</li><li> चमकाना 10 मिलियन उत्तेजक औधधि (3.3 Gy) PBMC और एक 50cm करने के लिए जोड़ने³ सेल संस्कृति फ्लास्क. लेबल "सह संस्कृति नियंत्रण थोक".</li><li> फ्लास्क के लिए मुख्यमंत्री में 1 मिलियन मिलीग्राम / प्रत्युत्तर PBMC के 10ml जोड़ें और धीरे कुप्पी ईमानदार 72 घंटे के लिए एक मशीन में रखकर पहले मिश्रण.</li></ol><p class="jove_title"> 4. प्राथमिक मिश्रित लिम्फोसाइट (MLR) रिएक्शन सह stimulatory नाकाबंदी की प्रभावकारिता उपाय की स्थापना</p><ol><li> Costimulatory नाकाबंदी की प्रभावकारिता एक प्राथमिक MLR जो सेट है थोक alloanergizing और नियंत्रण सह संस्कृतियों से PBMC उपयोग में मापा जाता है</li><li> प्राथमिक MLR उसी दिन है कि थोक संस्कृतियों गठन किया गया है पर सेट है</li><li> पहले लेबल यू एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रत्येक के लिए तीन बार अंक की (दिन 4, 5 और 6 के बाद प्लेटें सेट कर रहे हैं) मापा जा "प्राथमिक MLR" तली.</li><li> थोक नियंत्रण के प्रत्येक और 15ml फाल्कन ट्यूबों में सह संस्कृतियों alloanergizing से छानना 5ml.</li><li> पिपेट 200ml प्रत्येक प्लेट पर तीन प्रतियों कुओं में प्रत्येक फाल्कन ट्यूब से सेल निलंबन के. लेबल इन कुओं सह संस्कृतियों alloanergizing थोक नियंत्रण सह संस्कृतियों और थोक से कोशिकाओं के लिए "CSB" से कोशिकाओं के लिए "कोई costimulatory (CSB) नाकाबंदी"</li><li> प्रत्येक प्लेट पर नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 6 कुओं को मुख्यमंत्री की 200ml जोड़ें. 200ml पीबीएस सभी खाली कुओं को जोड़ा जाता है वाष्पीकरण कम. इनक्यूबेटर में रखें प्लेटें.</li></ol><p class="jove_title"> 5. माध्यमिक MLR स्थापना Alloanergization की प्रभावकारिता उपाय</p><ol><li> 72 घंटे सह संस्कृतियों थोक की स्थापना के बाद, alloanergized PBMCs में अवशिष्ट alloresponses एक माध्यमिक MLR में मापा जाता है. माध्यमिक MLR PBMC में दोनों थोक सह alloanergizing संस्कृति और थोक नियंत्रण सह संस्कृति से धोया और विकिरणित allostimulator PBMC साथ restimulated</li><li> माध्यमिक MLR लेबल सेट यू एक 96 अच्छी तरह से थाली "तीन बार (3 दिन, 5 और 7 के बाद स्थापित) मापा जा अंकों की प्रत्येक के लिए माध्यमिक MLR" तली.</li><li> थोक नियंत्रण के प्रत्येक से 5ml निकालें और सह संस्कृतियों alloanergizing, 15ml फाल्कन ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और 2000 में 5-10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ध्यान से सतह पर तैरनेवाला rpm.Aspirate, गोली बाधित, मुख्यमंत्री के 10ml जोड़ने और कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र. इस धोने कदम दोहराएँ.</li><li> मुख्यमंत्री की 1ml में कोशिकाओं Resuspend. व्यवहार्य Trypan ब्लू धुंधला का उपयोग कोशिकाओं की गणना, और 1 मिलियन व्यवहार्य प्रत्युत्तर कोशिकाओं / एमएल सेल एकाग्रता समायोजित.</li><li> पिपेट 100ml प्रत्येक प्लेट की तीन प्रतियों कुओं में प्रत्येक फाल्कन ट्यूब से सेल निलंबन के. इन कुओं "पहले पार्टी allorestimulation (एफपी)" लेबल</li><liप्रत्येक फाल्कन ट्यूब से पिपेट सेल निलंबन के प्रत्येक प्लेट और लेबल पर एक और 3 कुओं में 100ml इन कुओं "उत्तेजना CD3/28"</li><li> माध्यमिक MLR के लिए उत्तेजक औधधि कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, alloanergizing नियंत्रण और संस्कृतियों में पहली पार्टी उत्तेजक औधधि PBMCs की आपूर्ति के लिए इस्तेमाल किया ही स्वस्थ दाता से ताजा रक्त (या पुनर्जीवित cryopreserved PBMC) से PBMC अलग.</li><li> एफपी दाता से 1 मिलियन / एमएल और चमकाना (3.3Gy) के एक एकाग्रता में PBMC निलंबित</li><li> कुओं लेबल "एफपी allorestimulation" विकिरणित उत्तेजक औधधि कोशिकाओं के 100ml जोड़ें</li><li> सकारात्मक नियंत्रण के लिए, "CD3/28 उत्तेजना" लेबल कुओं को 1 एमएल CD3 के प्रत्येक और CD28 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और मुख्यमंत्री के 98mL जोड़ें. एक नकारात्मक नियंत्रण और खाली कुओं पीबीएस के 200ml के रूप में 6 प्रत्येक प्लेट पर कुओं को मुख्यमंत्री के 200 एमएल जोड़ें. इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Alloanergization की विशिष्टता को मापने</p><ol><li> Alloanergization की विशिष्टता प्रत्युत्तर माध्यमिक में एक "तीसरी पार्टी" स्वस्थ दाता (यानी पहले पार्टी के लिए एक अलग दाता) से प्राप्त विकिरणित PBMC के साथ उत्तेजना के बाद पूरा alloanergizing और नियंत्रण सह संस्कृतियों से ली गई कोशिकाओं के प्रसार की तुलना द्वारा निर्धारित किया जाता है MLR.</li><liलेबल> तीन 96 अच्छी तरह प्लेटें "माध्यमिक MLR विशिष्टता" दिन 3, 5 और 7.</li><li> थोक नियंत्रण के प्रत्येक से 5ml निकालें और सह संस्कृतियों 15ml फाल्कन ट्यूबों के हस्तांतरण और 2000 rpm पर 5-10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र alloanergizing. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला Aspirate, गोली बाधित, मुख्यमंत्री के 10ml जोड़ने और कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र. इस धोने कदम दोहराएँ.</li><li> मुख्यमंत्री की 1ml में कोशिकाओं Resuspend. Trypan ब्लू धुंधला का उपयोग कर की गणना, और 1 मिलियन व्यवहार्य प्रत्युत्तर कोशिकाओं / एमएल सेल एकाग्रता समायोजित.</li><li> माध्यमिक MLR के लिए तीसरे पक्ष के उत्तेजक औधधि कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, एक नया स्वस्थ दाता से ताजा रक्त (या cryopreserved PBMC पुनर्जीवित) से PBMC अलग. पिपेट सेल निलंबन के प्रत्येक प्लेट की तीन प्रतियों कुओं में प्रत्येक फाल्कन ट्यूब से 100ml. इन कुओं "टी.पी. allostimulation" लेबल</li><li> एक टी.पी. दाता से 1 मिलियन / एमएल और चमकाना (3.3 Gy) पर PBMC निलंबित</li><li> कुओं लेबल "टी.पी. allostimulation" विकिरणित टी.पी. उत्तेजक औधधि कोशिकाओं के 200ml जोड़ें</li><li> Alloanergization की विशिष्टता भी प्रत्युत्तर और पूरा सीएमवी के रूप में एक संक्रामक रोगज़नक़ के साथ उत्तेजना के बाद सह संस्कृतियों नियंत्रण alloanergizing से ली गई कोशिकाओं के प्रसार की तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इस कदम के लिए यह आवश्यक है पहले दिखा सीएमवी lysate proliferative प्रतिक्रियाओं के साथ दाताओं से प्रत्युत्तर PBMC का उपयोग.</li><li> लेबल तीन 96 अच्छी तरह से "माध्यमिक MLR सीएमवी" दिन 3 प्लेटें, 5 और 7.</li><li> माध्यमिक MLR के लिए प्रत्युत्तर कोशिकाओं को तैयार सीएमवी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए थोक नियंत्रण के प्रत्येक से 5 मिलीलीटर हस्तांतरण और 15 मिलीलीटर ट्यूबों सह संस्कृतियों alloanergizing और धोने, गिनती और 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल मुख्यमंत्री में resuspend के रूप में पहले वर्णित सेल निलंबन के प्रत्येक फाल्कन ट्यूब से प्रत्येक प्लेट पर एक 3 कुओं में पिपेट 100ml.</li><li> 100ul मुख्यमंत्री में कुओं सीएमवी lysate का 0.1 एमएल जोड़ें</li><li> एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सभी की थाली पर 6 कुओं को मुख्यमंत्री के 200 एमएल जोड़ें और खाली कुओं पीबीएस के 200ml जोड़ने. इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस.</li></ol><p class="jove_title"> 7. प्राथमिक और माध्यमिक MLRs में परमाणु अप्रसार को मापने</p><ol><li> प्रत्युत्तर सेल प्रसार thymidine प्राथमिक और माध्यमिक MLRs में समावेश परख द्वारा मापा जाता है. परमाणु अप्रसार दिन 4, 5 और 6 पर मापा जाता है के बाद प्राथमिक MLR प्लेटें सेट कर रहे हैं और माध्यमिक MLR प्लेटों के बाद 3 दिन, 5 और 7 में स्थापित कर रहे हैं.</li><litritiated thymidine> 1mCi 16 घंटे कुओं को जोड़ा जाता है कटाई करने के लिए पहले</li><li> Tritiated thymidine के अलावा के बाद, थाली एक further16 तो एक फिल्टर Tomtec हारवेस्टर (या समान) का उपयोग कर चटाई पर काटा घंटे के लिए incubated है. एयर सूखी एक घंटे के लिए तो एक नमूना बैग में जगह, 5 एमएल जगमगाहट तरल पदार्थ और मुहर जोड़ने filtermat. पढ़ें Wallac माइक्रो बीटा काउंटर या इसी तरह की जगमगाहट में थाली.</li></ol><p class="jove_title"8>. प्राथमिक MLR में सह stimulatory नाकाबंदी की प्रभावकारिता गिना</p><ol><li> प्राथमिक alloresponses का प्रतिशत निषेध (पीआई) 100 के रूप में परिकलित किया जाता है एक्स [मतलब allostimulation कुओं में सीपीएम (थोक alloanergy PBMC सह संस्कृति) – allostimulation कुओं में सीपीएम (थोक नियंत्रण PBMC सह संस्कृति) मतलब}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" ></ol><p class="jove_title"9>. माध्यमिक MLR में Alloanergization की प्रभावकारिता की गणना</p><p class="jove_content"> माध्यमिक alloresponses की PI के रूप में परिकलित किया जाता है<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" ><p class="jove_title"> 10. माध्यमिक MLR में Alloanergization की विशिष्टता गिना</p><ol><li> CD3 और CD28 के साथ कोशिकाओं के restimulation के बाद, टी.पी. allostimulators या सीएमवी प्रतिजन, इन stimuli करने के लिए प्रतिक्रियाओं के पीआई भी इस सूत्र का उपयोग कर की गणना जा सकता है. यह alloanergization प्रक्रिया की विशिष्टता का एक उपाय देता है</li></ol><p class="jove_title"11>. क्लीनिकल allogeneic hematopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद का उपयोग करें (HSCT) के लिए Alloanergized दाता PBMC उत्पन्न</p><ol><li> Alloanergized दाता PBMC एचएलए बेमेल allogeneic ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग HSCT बाद नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए उत्पन्न किया जा सकता है</li><li> जब नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए पैदा कोशिकाओं, प्रत्युत्तर PBMC HSCT दाता और उत्तेजक औधधि PBMC से HSCT पहले प्राप्तकर्ता के लिए प्रत्यारोपण से प्राप्त कर रहे हैं.</li><li> जब नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए पैदा PBMC, सभी चरणों का मान्यता प्राप्त स्टेम सेल प्रसंस्करण सुविधाओं में अच्छा विनिर्माण प्रक्रिया की शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं.</li><li> अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण assays endotoxin assays सहित ग्राम दाग संस्कृति और सुरक्षा मापदंड नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए कक्षों की रिहाई से पहले मिलना प्रदर्शन कर रहे हैं</li></ol><p class="jove_title"12>. प्रतिनिधि परिणाम</p><p class="jove_content"> का प्रयोग एचएलए बेमेल उत्तेजक औधधि और प्रत्युत्तर PBMC, प्राथमिक MLR में costimulatory नाकाबंदी की उपस्थिति में देखा है कि 5 दिन में लगभग 30% (मानक विचलन – 10%, + / मतलब + /) प्रत्युत्तर PBMC का मतलब alloproliferation कम कर देता है नियंत्रण costimulatory नाकाबंदी के अभाव में प्राथमिक MLR. यह लगभग 70% (+ / – 10%) की प्राथमिक alloproliferation का मतलब निषेध के बराबर है D5,<strong> चित्रा ए 1 और बी</strong>.</p><p class="jove_content"> 5 दिवस पर माध्यमिक MLR में, alloanergized PBMC के एफपी alloproliferation आमतौर पर 10-15% (+ / – 10%) नियंत्रण PBMC 85-90% के प्रसार का मतलब निषेध (समकक्ष के साथ देखा है कि + / – 10 %),<strong> चित्रा 2A और बी</strong>. यह दर्शाता है कि alloanergized PBMC एफपी allostimulators hyporesponsive हैं.</p><p class="jove_content"> इसके विपरीत alloanergized PBMC में आम तौर पर उनके प्रसार के mitogens (CD3/CD28 एंटीबॉडी) के लिए 70-100% बनाए रखने के लिए, टी.पी. allostimulators और सीएमवी lysate (सीएमवी प्रतिक्रियाशील दाताओं में). यह दर्शाता है alloanergized PBMC की है कि hyporesponsiveness एफपी alloantigens के लिए विशिष्ट है.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> चित्रा 1. ए</strong> प्रसार (thymidine निगमन द्वारा निर्धारित एक मिश्रित प्राथमिक लिम्फोसाइट रिएक्शन अनुपस्थिति में एचएलए बेमेल उत्तेजक औधधि और प्रत्युत्तर परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) का उपयोग कर या costimulatory humanized मोनोक्लोनल विरोधी B7.1 और B7.2 – का उपयोग करते हुए नाकाबंदी की उपस्थिति में) एंटीबॉडी. परिणाम 8 प्रतिनिधि अद्वितीय उत्तेजक औधधि प्रत्युत्तर जोड़े का उपयोग कर प्रयोगों के लिए मतलब (+ / – एसडी) के रूप में दिखाए जाते हैं.<strong> बी</strong>. Alloproliferation के प्राथमिक costimulatory humanized मोनोक्लोनल विरोधी B7.1 और B7.2 एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए नाकाबंदी की उपस्थिति में प्रदर्शन MLRs में प्रतिशत निषेध. परिणाम वही 8 अनन्य उत्तेजक औधधि प्रत्युत्तर 1A चित्र में दर्शाया जोड़े के लिए मतलब (+ / – एसडी) के रूप में दिखाए जाते हैं.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> चित्रा 2. ए</strongमाध्यमिक> प्रसार (thymidine निगमन द्वारा निर्धारित). परिणाम 8 अद्वितीय उत्तेजक औधधि प्रत्युत्तर चित्र 1 में दर्शाया जोड़े के लिए मतलब (+ / – एसडी) के रूप में दिखाए जाते हैं.<strong> बी</strong>. माध्यमिक MLRs जहां प्रत्युत्तर PBMC प्राथमिक अनुपस्थिति (नियंत्रण PBMC) या costimulatory नाकाबंदी (alloanergized PBMC) की उपस्थिति में प्रदर्शन MLRs से विकिरणित पहली पार्टी stimulators साथ restimulated में प्रथम पक्ष alloproliferation का प्रतिशत निषेध. परिणाम 8 अद्वितीय उत्तेजक औधधि प्रत्युत्तर 1 चित्रा और चित्रा 2A में चित्रित जोड़े के लिए मतलब (+ एसडी – /) के रूप में दिखाए जाते हैं.</p>

Discussion

<p class="jove_content"> Alloantigen विशिष्ट hyporesponsiveness, या anergy के सह stimulatory नाकाबंदी की उपस्थिति में allostimulation के माध्यम से दाता PBMC में, प्रेरण कम alloreactivity साथ दाता PBMC की पीढ़ी के लिए एक सरल तकनीक है. हम प्रयोगशाला में प्रक्रिया को विकसित किया है और वर्तमान क्लिनिक में एचएलए बेमेल allogeneic HSCT बाद जलसेक के लिए कम alloreactivity के साथ दाता PBMC उत्पन्न रणनीति लागू करने. ऐसी चिकित्सा का उपयोग करने के उद्देश्य के लिए अतिरिक्त विषाक्तता के बिना प्रतिरक्षा पुनर्गठन में सुधार है. हालांकि हमारी रणनीति के मौजूदा नैदानिक ​​आवेदन allogeneic HSCT के स्थापित करने के लिए सीमित है, दृष्टिकोण अन्य सेटिंग्स जहां ऊतकों को नुकसान अवांछित ऐसे ठोस अंग प्रत्यारोपण या autoimmune शर्तों के अस्वीकृति के रूप में टी सेल प्रतिक्रिया के कारण होता है के लिए लागू किया जा सकता है.</p><p class="jove_content"> कई अभिकर्मकों alloanergization सह संस्कृति प्रक्रिया के दौरान CD28 की मध्यस्थता सह stimulatory संकेतों के नाकाबंदी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ हम हमारे वर्तमान नैदानिक ​​ग्रेड humanized murine मोनोक्लोनल CD28 (B7.1 और B7.2) के ligands के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन. गैर नैदानिक ​​ग्रेड murine विरोधी मानव B7.1 और B7.2 एंटीबॉडी वाणिज्यिक कई निर्माताओं से उपलब्ध हैं. वैकल्पिक रूप से, संलयन प्रोटीन साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (CTLA) 4-इम्यूनोग्लोबिन एंटीजन (आईजी) alloanergization प्रक्रिया के दौरान CD28 costimulation ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. CTLA4 – पुलिस महानिरीक्षक, जो CTLA4 आईजीजी एफसी गामा रिसेप्टर से जुड़े अणु के बाह्य भाग की होते हैं उच्च आत्मीयता के साथ B7.1 और B7.2 के लिए बांधता है. CTLA4 के पुलिस महानिरीक्षक के उपयोग इसी तरह की प्रभावकारिता और मानव PBMCs के alloanergization विशिष्टता में परिणाम है.</p><p class="jove_content"> Alloanergization के प्रदर्शन करने के लिए सरल तकनीक है. ताजा या पहले cryopreserved उत्तेजक औधधि PBMCs प्रक्रिया के परिणाम में कोई महत्वपूर्ण बदलाव के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. केवल एक अपेक्षाकृत संक्षिप्त कोई सेल छँटाई प्रक्रियाओं के साथ पूर्व vivo ऊष्मायन कदम के लिए आवश्यकता कोशिका मृत्यु और कक्षों की बैक्टीरियल संदूषण जलसेक है जो अपेक्षाकृत एक नैदानिक ​​पैमाने पर लागू करने के लिए सरल रणनीति बनाता से पहले के लिए संभावित कम से कम.</p><p class="jove_content"> दृष्टिकोण हम वर्णन (और अन्य दृष्टिकोण चुनिंदा मानव कोशिकाओं के alloreactivity कम) की एक सीमा एक वास्तविक समय परख के अभाव अवशिष्ट alloreactivity निर्धारित है. प्रसार assays 3-5 दिनों लेने के लिए इन उपलब्ध होने assays के परिणाम से पहले संचार किया जाना चाहिए alloreactivity और नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए उत्पन्न कोशिकाओं की कमी की पुष्टि प्रदर्शन. इसके अलावा, thymidine निगमन द्वारा PBMCs के प्रसार की माप, हालांकि प्रदर्शन करने के लिए आसान है, टी सेल प्रसार के अलावा बी कोशिकाओं और अन्य सेल सबसेट के प्रसार के उपाय. CFSE प्रत्युत्तर PBMCs के कमजोर पड़ने डाई एक वैकल्पिक परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और टी सेल सबसेट विशेष alloproliferation के दृढ़ संकल्प परमिट है. एक ही रास्ता करने के लिए हमारी रणनीति के दृष्टिकोण के नैदानिक ​​आवेदन में सुधार को विकसित करने और alloreactivity का एक परख है कि केवल कुछ घंटे के लिए प्रदर्शन जो पहले किया जा सकता है नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए alloanergized कोशिकाओं की रिहाई लेता मान्य होगा.</p><p class="jove_content"> रणनीति है यह भी महत्वपूर्ण है विशिष्टता alloanergization प्रक्रिया की पुष्टि की efficiacy प्रदर्शन के अलावा. यह आसानी से तीसरे पक्ष allostimulators के लिए विशिष्ट alloresponses के सापेक्ष संरक्षण के दृढ़ संकल्प और जब सीएमवी प्रतिक्रियाशील दाता कोशिकाओं alloanergized किया जा रहा है के द्वारा किया जा proliferative प्रतिक्रियाओं के संरक्षण द्वारा सीएमवी के लिए हो</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio-Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning, Inc.	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Labware	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac