ampliPHOX colorimétrico de detección de un microarray de ADN para la influenza
Summary
ampliPHOX tecnología de detección colorimétrica se presenta como una alternativa económica a la detección por fluorescencia de microarrays. Sobre la base de fotopolimerización, ampliPHOX produce manchas de polímero sólido visible a simple vista en tan sólo unos minutos. Resultados son imágenes e interpretado de forma automática con un paquete de software simple pero poderosa.
Abstract
Microarrays de ADN se han convertido en una poderosa herramienta para la detección de patógenos. 1.5 Por ejemplo, muchos ejemplos de la capacidad de escribir y subtipo de virus de la influenza se ha demostrado. 11.6 La identificación y subtipificación de la influenza en microarrays de ADN tiene aplicaciones tanto en público la salud y la clínica para la detección temprana, intervención rápida, y minimizar el impacto de una pandemia de influenza. Fluorescencia tradicionales es actualmente el método de detección de microarrays de uso más común. Sin embargo, como la tecnología de microarrays avanza hacia el uso clínico, una sustitución de instrumentos caros, con tecnología de bajo costo de detección que presentan características de rendimiento similares a la fluorescencia se hacen ensayos de microarrays más atractivo y rentable.
La tecnología de detección colorimétrica ampliPHOX está diseñado para aplicaciones de investigación, y tiene un límite de detección dentro de un orden de magnitud de fluorescencia tradicionales 11, con una ventaja de ser un aproximado de diez veces menor coste en comparación con el instrumento de los escáneres de microarrays confocal de fluorescencia necesaria para microarrays detección. Otra ventaja es el tamaño compacto del instrumento que permite la portabilidad y flexibilidad, a diferencia de los instrumentos tradicionales de la fluorescencia. Debido a que la tecnología de polimerización no es tan intrínsecamente lineal, como la detección por fluorescencia, sin embargo, es el más adecuado para aplicaciones de baja densidad de microarrays en el que se desea una respuesta sí / no a la presencia de una cierta secuencia, por ejemplo, para matrices de detección de patógenos. En la actualidad la densidad de punto máximo compatible con la detección de ampliPHOX es de ~ 1800 puntos / matriz. Debido a las limitaciones de densidad lugar, una mayor densidad de microarrays no son adecuados para la detección de ampliPHOX.
A continuación, presentamos la tecnología de detección colorimétrica ampliPHOX como un método de amplificación de la señal en un microarray de baja densidad para la detección y caracterización de los virus de la influenza (FluChip). Aunque este protocolo utiliza el FluChip (un microarray de ADN) como una aplicación específica de ampliPHOX detección, los microarrays de la incorporación de meta con biotina puede ser etiquetada y se detecta de manera similar. El diseño de microarrays y biotinilación de la meta de ser capturados son responsabilidad del usuario. Una vez que el objetivo de biotina ha sido capturado en la matriz, la detección ampliPHOX se puede realizar mediante el etiquetado de la primera serie con un conjugado de estreptavidina-etiqueta (ampliTAG). Tras la exposición de luz mediante el instrumento ampliPHOX Reader, la polimerización de una solución de monómero (ampliPHY) sólo se produce en las regiones que contienen ampliTAG marcado objetivos. El polímero formado puede ser posteriormente se tiñeron con una solución no tóxica para mejorar el contraste visual, seguido por imágenes y análisis con un paquete de software simple (ampliVIEW). El ensayo FluChip, desde la no-extraídos de la muestra de resultados se puede realizar en unas 6 horas, y las medidas de detección ampliPHOX descrito anteriormente se puede completar en unos 30 min.
Protocol
Discussion
La tecnología de detección de ampliPHOX colorimétrico que aquí se presenta es una alternativa rápida y económica para la detección de un solo color de fluorescencia para aplicaciones de baja densidad de microarrays. Se muestra esquemáticamente en la Figura 1, el principio de detección se basa en el uso de una etiqueta fotoiniciador (1B). En presencia de una solución de monómero que contiene (1C), exposición a la luz hace que el fotoiniciador (ampliTAG) para desencadenar una reacción de poli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
InDevR reconoce NIH / NIAID U01AI070276 y R43AI077112 para la financiación de este trabajo.
Materials
| Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
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