يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية
Summary
خلايا الموت تنبثق من الأنسجة الطلائية التي تقلص متضافرة من الخلايا المجاورة دون تعطيل وظيفة الحاجز. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف أساليب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات في القرار الخلوية.
Abstract
استتبابي صيانة الأنسجة الطلائية المستمر يتطلب إزالة الخلايا التالفة من دون تعطيل وظيفة الحاجز. ووصف عملية دراستنا وجدنا أن الخلايا الميتة إرسال إشارات إلى جيرانهم العيش في تشكيل وعقد حلقة من الأكتين والميوسين التي يقذف بها من ورقة الظهارية في حين إغلاق أي ثغرات يمكن أن تكون قد نتجت عن خروجها ، قذف الخلية 1. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف الأسلوب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات. لتصور البثق ، ونحن حقن بروتين فلوري الأحمر المسبار المسمى لأكتين F – الأجنة في مرحلة واحدة خلايا معدلة وراثيا الزرد التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء في البشرة ويحفز موت الخلايا المبرمج عن طريق إضافة إلى G418 اليرقات. ثم نستخدم الوقت الفاصل بين التصوير على القرص الغزل مبائر المجهر لمراقبة ديناميات أكتين والسلوكيات الخلايا الظهارية أثناء عملية قذف الخلية أفكارك. هذا الأسلوب يتيح لنا للتحقيق في عملية قذف في ظهائر العيش وسوف توفر وسيلة لدراسة الحالات المرضية الناجمة عن الفشل في القضاء على الخلايا أفكارك.
Protocol
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوضح طريقة بسيطة ومباشرة لتصور عملية البثق في منديل الظهارية حية. هذا النوع من التجربة تسمح لنا دراسة ديناميات أكتين الدقيقة لا تقدر سابقا في تحليل الأنسجة الثابتة ، وبالتالي يكمل أساليب مناعي مشترك. يمكننا استخدام هذا البروتوكول في تركيبة مع ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء روزنبلات المختبر العلمي للمناقشات والاقتراحات والتعليقات. نود أيضا أن نشكر الذين قدموا ماري هالوران يرجى الترميز البلازميد RFP – UtrCH وجرونوالد ديفيد الذي قدم CK : GFP الزرد المعدلة وراثيا. أيضا بفضل جريتشين الملك وموظفي الموارد اسماك الزرد المركزية في جامعة ولاية يوتا لصيانة ممتازة ورعاية الزرد. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، جائزة NIGMS NIH المدير الجديد المبتكر 1 DP2 OD002056 – 01 إلى JR. كان مدعوما من قبل GTE التدريب NIH السرطان المتعدد التخصصات 5T32 برنامج منح CA03247 – 8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
