Живая изображения клеточных Экструзия из эпидермиса развивающихся данио рерио
Summary
Умирающие клетки выдавливается из эпителиальной ткани согласованные сокращения соседние клетки, не нарушая барьерную функцию. Оптической прозрачности развития данио обеспечивает отличная система для визуализации экструзии в живых эпителия. Здесь мы опишем методы, чтобы вызвать и изображения экструзии в личиночной эпидермиса данио на клеточном разрешения.
Abstract
Гомеостатические поддержания эпителиальных тканей требует постоянного удаления поврежденных клеток, не нарушая барьерную функцию. Наши исследования показали, что умирающие клетки посылают сигналы в их живых соседей, чтобы форма и контракт кольцо актина и миозина, что выбрасывает его из эпителиальных листа при закрытии каких-либо пробелов, которые могут быть результатом его выход, и этот процесс называется ячейка экструзии 1. Оптической прозрачности развития данио обеспечивает отличная система для визуализации экструзии в живых эпителия. Здесь мы опишем метод, чтобы побудить и изображения экструзии в личиночной эпидермиса рыбок данио. Для визуализации экструзии, мы вводим красный флуоресцентный белок меченного зонда для F-актина в одно-клеточной стадии трансгенных эмбрионов данио выражения зеленого флуоресцентного белка в эпидермис и вызывать апоптоз путем добавления G418 для личинок. Затем с помощью покадровой изображения на вращающийся диск конфокальной микроскопии для наблюдения динамики актина и эпителиальных поведения клетка в процессе апоптоза клетка экструзии. Такой подход позволяет исследовать процесс экструзии в живых эпителия и будет предоставлять проспект изучать болезненных состояний, вызванных неустранения апоптоза клеток.
Protocol
Discussion
Протокол, описанный здесь, демонстрирует простой и прямой способ для визуализации процесса экструзии в живых эпителиальной ткани. Такого рода эксперимент позволяет нам изучить тонкости актина динамики не ранее оценил в основной анализ ткани, и, следовательно, дополняет общую иммуноф?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лаборатории Розенблатт для научных дискуссий, предложения и замечания. Мы также хотели бы поблагодарить Марию Халлоран который любезно предоставил плазмиды, кодирующей RFP-UtrCH и Дэвид Грюнвальд, которые предоставили CK: GFP трансгенных данио. Спасибо также Гретхен Король и сотрудниками централизованных ресурсов данио рерио в Университете штата Юта, за отличное обслуживание и уход за рыбок данио. Работа выполнена при поддержке нью-Новатор NIH-NIGMS NIH директора премии 1 DP2 OD002056-01 для JR. ГТД была поддержана NIH многопрофильная рака Программа обучения Грант 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
