הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח
Summary
תאים מתים נמתחים מרקמות אפיתל על ידי התכווצות מתואמת של תאים שכנים מבלי לשבש תפקוד מחסום. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטות לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל ברזולוציה הסלולר.
Abstract
תחזוקה homeostatic של רקמות אפיתל דורש את הסרת מתמדת של תאים פגומים מבלי לשבש תפקוד מחסום. המחקרים שלנו מצאו כי תאים מתים לשלוח אותות חיים לשכנים שלהם הטופס חוזה טבעת של אקטין שרירן כי זה פולט מתוך גיליון אפיתל ואילו לסגור פערים שאולי נבעה היציאה שלה, תהליך שמכונה שחול תא 1. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטה לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל. כדי להמחיש שחול, אנו מזריקים בדיקה אדום חלבון פלואורסצנטי שכותרתו עבור אקטין-F לתוך אחד התאים הטרנסגניים בשלב עוברי דג הזברה לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק של האפידרמיס להשרות אפופטוזיס על ידי תוספת של G418 אל הזחלים. לאחר מכן, אנו משתמשים זמן לשגות הדמיה במיקרוסקופ על דיסק מסתובב confocal לצפות בדינמיקה אקטין והתנהגויות תא אפיתל בתהליך של תאים אפופטוטיים שחול. גישה זו מאפשרת לנו לחקור את התהליך שחול ב לחיות epithelia ותספק שדרה ללמוד מדינות מחלה הנגרמת על ידי הכישלון לחסל תאים אפופטוטיים.
Protocol
Discussion
פרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטה פשוט וברור כדי להמחיש את התהליך של שחול ברקמות האפיתל לחיות. סוג זה של הניסוי מאפשר לנו לבחון את הדקויות של אקטין דינמיקה לא העריכו בעבר מנתח רקמות קבוע, ולכן, משלים שיטות immunofluorescent משותף. אנו יכולים להשתמש בפרוטוקול זה בשילוב עם מעכבי כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי במעבדה רוזנבלט לדיונים, הצעות מדעיים, והערות. אנחנו רוצים גם להודות מרי הלוראן אשר חביב סיפק את הקידוד פלסמיד-RFP UtrCH דוד גרינוולד שסיפק את CK: GFP מהונדס דג הזברה. תודה גם גרטשן המלך וצוות משאבים דג הזברה מרכזי באוניברסיטת יוטה תחזוקה טיפול מעולה של דג הזברה. עבודה זו נתמכה על ידי פרס ממציא ניו NIH-NIH NIGMS המנהל 1 DP2 OD002056-01 ל JR. GTE נתמכה על ידי NIH הדרכה רב תחומית סרטן תוכנית גרנט 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
