विकास Zebrafish के epidermis से सेल एक्सट्रूज़न लाइव इमेजिंग
Summary
मर कोशिकाओं उपकला ऊतकों से पड़ोसी की कोशिकाओं के ठोस संकुचन द्वारा बाधा समारोह में खलल न डालें बिना extruded कर रहे हैं. zebrafish के विकास के ऑप्टिकल स्पष्टता के लिए एक उत्कृष्ट epithelia में रहने वाले बाहर निकालना कल्पना प्रणाली प्रदान करता है. यहाँ हम विधियों का वर्णन करने के लिए प्रेरित और सेलुलर संकल्प पर लार्वा zebrafish epidermis में छवि बाहर निकालना.
Abstract
उपकला ऊतकों की homeostatic रखरखाव क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की बाधा समारोह में खलल न डालें बिना नित्य हटाने की आवश्यकता है. हमारे अध्ययन ने पाया है कि उनके रहने पड़ोसियों के लिए मर कोशिकाओं संकेतों को भेजने के लिए फार्म और actin और मायोसिन की एक अंगूठी है कि यह ejects उपकला पत्रक से बाहर करते हुए किसी भी अंतर है कि इसके बाहर से परिणाम हो सकता है है बंद अनुबंध, एक प्रक्रिया कोशिका 1 बाहर निकालना करार दिया. zebrafish के विकास के ऑप्टिकल स्पष्टता के लिए एक उत्कृष्ट epithelia में रहने वाले बाहर निकालना कल्पना प्रणाली प्रदान करता है. यहाँ हम एक विधि का वर्णन करने के लिए प्रेरित और लार्वा zebrafish epidermis में छवि बाहर निकालना. बाहर निकालना कल्पना करने के लिए, हम एफ actin के लिए एक सेल चरण ट्रांसजेनिक zebrafish epidermis में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त भ्रूण में एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल जांच और इंजेक्षन G418 के लार्वा के अलावा द्वारा apoptosis प्रेरित. हम तो एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन पर समय चूक इमेजिंग उपयोग apoptotic सेल बाहर निकालना की प्रक्रिया के दौरान actin गतिशीलता और उपकला कोशिका व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए. यह दृष्टिकोण हमें जीना epithelia में बाहर निकालना प्रक्रिया की जांच करने के लिए अनुमति देता है और रोग apoptotic कोशिकाओं को खत्म करने की विफलता की वजह से राज्यों को अध्ययन के लिए एक अवसर प्रदान करेगा.
Protocol
Discussion
यहाँ वर्णित एक सरल और सीधा एक जीवित उपकला ऊतक में बाहर निकालना की प्रक्रिया कल्पना विधि प्रोटोकॉल को दर्शाता है. प्रयोग के इस प्रकार हमें actin गतिशीलता निर्धारित ऊतक विश्लेषण में पहले नहीं की सराहना की ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वैज्ञानिक चर्चा, सुझाव, और टिप्पणियों के लिए Rosenblatt प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. GFP ट्रांसजेनिक zebrafish हम भी मेरी Halloran जो कृपया प्लाज्मिड एन्कोडिंग आरएफपी UtrCH और डेविड Grunwald जो सी.के. प्रदान प्रदान धन्यवाद देना चाहूंगा. धन्यवाद भी ग्रेचेन राजा और यूटा विश्वविद्यालय में केन्द्रीकृत Zebrafish संसाधन के उत्कृष्ट और zebrafish के रखरखाव और देखभाल के लिए कर्मचारियों को. यह काम NIH-NIGMS NIH निदेशक नई अन्वेषक जे आर के लिए एक पुरस्कार OD002056-01 DP2 द्वारा समर्थित किया गया था. GTE NIH इन दोनों क्षेत्रों कैंसर प्रशिक्षण कार्यक्रम अनुदान CA03247 8-5T32 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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