Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo
Summary
Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L'ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell'epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.
Abstract
Mantenimento dell'omeostasi dei tessuti epiteliali richiede la rimozione continua di cellule danneggiate senza interrompere la funzione di barriera. I nostri studi hanno trovato che le cellule morenti inviare segnali ai loro vicini di formare e vivere contratto un anello di actina e miosina che lo espelle fuori dal foglio epiteliali durante la chiusura eventuali lacune che potrebbero avere provocato dalla sua uscita, un processo chiamato estrusione in cella 1. L'ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrive un metodo per indurre e estrusione immagine nell'epidermide zebrafish larvale. Per visualizzare estrusione, abbiamo iniettare una sonda rossa proteina fluorescente etichettato per la F-actina in una cella di embrioni di zebrafish fase transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde a livello epidermico e indurre apoptosi mediante l'aggiunta di G418 di larve. Utilizziamo quindi time-lapse imaging su un microscopio confocale a disco rotante per osservare dinamiche di actina e dei comportamenti delle cellule epiteliali durante il processo di estrusione cellulare per apoptosi. Questo approccio ci permette di indagare il processo di estrusione a vivere epiteli e fornirà una via per studiare stati di malattia causata dalla mancata eliminazione di cellule apoptotiche.
Protocol
Discussion
Il protocollo qui descritto viene illustrato un metodo semplice e diretto per visualizzare il processo di estrusione in un tessuto vivo epiteliale. Questo tipo di esperimento ci permette di esaminare sottigliezze delle dinamiche di actina in precedenza non apprezzati nelle analisi del tessuto fisso, e quindi, integra comuni metodi di immunofluorescenza. Possiamo usare questo protocollo in associazione con inibitori chimici o mutanti genetici per analizzare meglio il processo di estrusione e stati patologici studio assoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Rosenblatt per discussioni scientifiche, suggerimenti e commenti. Vorremmo anche ringraziare Maria Halloran che ha gentilmente fornito la codifica plasmide RFP-UtrCH e David Grunwald che ha fornito il CK: GFP zebrafish transgenico. Grazie anche a Gretchen re e il personale della risorsa Zebrafish centralizzata presso l'Università dello Utah per la manutenzione eccellente e la cura del pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto da Innovator Award di New NIH-NIGMS direttore del NIH di 1 DP2 OD002056-01 a JR. GTE è stato sostenuto dalla formazione multidisciplinare del cancro del NIH Grant Program 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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